از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
توکسوپلاسما گوندی یک انگل تک یاخته درون سلولی است که ریزمحیط میزبان آلوده را تعدیل می کند و شناخته شده است که با بروز رشد تومور مغزی مرتبط است.در این مطالعه، ما فرض می کنیم که miRNA-21 اگزوزومی از عفونت توکسوپلاسما باعث رشد تومور مغزی می شود.اگزوزوم از میکروگلیای BV2 آلوده به توکسوپلاسما مشخص شد و درونی سازی سلول های گلیوما U87 تایید شد.پروفایل های بیان microRNA اگزوزومی با استفاده از آرایه های microRNA و microRNA-21A-5p مرتبط با توکسوپلاسما گوندی و مرتب سازی تومور مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.ما همچنین سطوح mRNA ژن‌های مرتبط با تومور را در سلول‌های گلیوما U87 با تغییر سطوح miR-21 در اگزوزوم‌ها و تأثیر اگزوزوم‌ها بر تکثیر سلول‌های گلیوما U87 انسانی بررسی کردیم.در اگزوزوم سلول های گلیوما U87 آلوده به توکسوپلاسما گوندی، بیان microRNA-21 افزایش یافته و فعالیت ژن های ضد تومور (FoxO1، PTEN و PDCD4) کاهش می یابد.اگزوزوم های مشتق شده از BV2 آلوده به توکسوپلاسما باعث تکثیر سلول های گلیوما U87 می شوند.اگزوزوم ها باعث رشد سلول های U87 در مدل تومور موش می شوند.ما پیشنهاد می‌کنیم که افزایش miR-21 اگزوزومی در میکروگلیاهای BV2 آلوده به توکسوپلاسما ممکن است نقش مهمی را به عنوان یک محرک رشد سلولی در سلول‌های گلیوما U87 با کاهش ژن‌های ضد تومور ایفا کند.
تخمین زده می شود که در سال 2018 بیش از 18.1 میلیون مورد سرطان پیشرفته در سراسر جهان تشخیص داده شده است که هر سال حدود 297000 تومور سیستم عصبی مرکزی (1.6٪ از کل تومورها) تشخیص داده می شود.تحقیقات قبلی نشان داده است که عوامل خطر برای ایجاد تومورهای مغزی انسان شامل محصولات شیمیایی مختلف، سابقه خانوادگی و پرتوهای یونیزان از تجهیزات درمانی و تشخیصی سر است.با این حال، علت دقیق این بدخیمی ها ناشناخته است.تقریباً 20 درصد از کل سرطان ها در سراسر جهان توسط عوامل عفونی از جمله ویروس ها، باکتری ها و انگل ها ایجاد می شوند.پاتوژن های عفونی مکانیسم های ژنتیکی سلول میزبان مانند تعمیر DNA و چرخه سلولی را مختل می کنند و می توانند منجر به التهاب مزمن و آسیب به سیستم ایمنی بدن شوند.
عوامل عفونی مرتبط با سرطان انسان شایع ترین پاتوژن های ویروسی از جمله ویروس های پاپیلومای انسانی و ویروس های هپاتیت B و C هستند.انگل ها همچنین می توانند نقش بالقوه ای در ایجاد سرطان انسان ایفا کنند.چندین گونه انگل، یعنی Schistosoma، Opishorchis viverrini، O. felineus، Clonorchis sinensis و Hymenolepis nana، در انواع مختلف سرطان انسان نقش دارند.
Toxoplasma gondii یک تک یاخته درون سلولی است که ریزمحیط سلول های میزبان آلوده را تنظیم می کند.تخمین زده می شود که این انگل تقریباً 30 درصد از جمعیت جهان را آلوده می کند و کل جمعیت را در معرض خطر قرار می دهد.توکسوپلاسما گوندی می تواند اندام های حیاتی از جمله سیستم عصبی مرکزی (CNS) را آلوده کند و باعث بیماری های جدی مانند مننژیت کشنده و آنسفالیت، به ویژه در بیماران دچار نقص ایمنی شود.با این حال، توکسوپلاسما گوندی همچنین می‌تواند محیط میزبان آلوده را با تعدیل رشد سلولی و پاسخ‌های ایمنی در افراد دارای ایمنی، تغییر دهد که منجر به حفظ عفونت مزمن بدون علامت می‌شود.جالب توجه است، با توجه به همبستگی بین شیوع T. gondii و بروز تومور مغزی، برخی گزارش‌ها نشان می‌دهند که تغییرات محیطی میزبان in vivo ناشی از عفونت مزمن T. gondii شبیه ریزمحیط تومور است.
اگزوزوم ها به عنوان ارتباط دهنده های بین سلولی شناخته می شوند که محتوای بیولوژیکی، از جمله پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک را از سلول های همسایه تحویل می دهند.اگزوزوم ها می توانند بر فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط با تومور مانند ضد آپوپتوز، رگزایی و متاستاز در ریزمحیط تومور تأثیر بگذارند.به طور خاص، miRNA ها (miRNA)، RNA های کوچک غیر کدکننده با طول حدود 22 نوکلئوتید، تنظیم کننده های ژن مهم پس از رونویسی هستند که بیش از 30 درصد از mRNA انسانی را از طریق کمپلکس خاموش کننده ناشی از miRNA (miRISC) کنترل می کنند.توکسوپلاسما گوندی می تواند فرآیندهای بیولوژیکی را با کنترل بیان miRNA در میزبان های آلوده مختل کند.miRNA های میزبان حاوی سیگنال های مهمی برای تنظیم فرآیندهای بیولوژیکی میزبان برای دستیابی به استراتژی بقای انگل هستند.بنابراین، مطالعه تغییرات در پروفایل miRNA میزبان پس از عفونت با T. gondii می تواند به ما کمک کند تا تعامل بین میزبان و T. gondii را واضح تر درک کنیم.در واقع، Thirugnanam و همکاران.15 پیشنهاد کرد که T. gondii با تغییر بیان آن بر روی miRNA های میزبان خاص مرتبط با رشد تومور، سرطان زایی مغز را ارتقا می دهد و دریافت که T. gondii می تواند باعث ایجاد گلیوم در حیوانات آزمایشگاهی شود.
این مطالعه بر روی تغییر اگزوزوم miR-21 در میکروگلیاهای میزبان آلوده به توکسوپلاسما BV2 تمرکز دارد.ما نقش احتمالی miR-21 اگزوزومی تغییر یافته را در رشد سلول های گلیوما U87 به دلیل حفظ در هسته FoxO1/p27، که هدف miR-21 بیش از حد بیان شده است، مشاهده کردیم.
اگزوزوم های مشتق شده از BV2 با استفاده از سانتریفیوژ دیفرانسیل به دست آمد و با روش های مختلف اعتبار سنجی شد تا از آلودگی با اجزای سلولی یا سایر وزیکول ها جلوگیری شود.الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) الگوهای متمایزی را بین پروتئین‌های استخراج‌شده از سلول‌های BV2 و اگزوزوم‌ها نشان داد (شکل 1A)، و نمونه‌ها برای حضور Alix مورد ارزیابی قرار گرفتند که با وسترن بلات نشانگرهای پروتئین اگزوزومی در .برچسب‌گذاری Alix در پروتئین‌های اگزوزوم یافت شد اما در پروتئین‌های لیزات سلولی BV2 یافت نشد (شکل 1B).علاوه بر این، RNA خالص از اگزوزوم های مشتق شده از BV2 با استفاده از یک بیوانالایزر تجزیه و تحلیل شد.زیر واحدهای ریبوزومی 18S و 28S به ندرت در الگوی مهاجرت RNA اگزوزومی مشاهده شدند که نشان دهنده خلوص قابل اعتماد است (شکل 1C).در نهایت، میکروسکوپ الکترونی عبوری نشان داد که اگزوزوم‌های مشاهده‌شده اندازه‌ای در حدود 60 تا 150 نانومتر دارند و ساختاری فنجان مانند معمولی مورفولوژی اگزوزوم دارند (شکل 1D).
خصوصیات اگزوزوم های مشتق شده از سلول های BV2.(الف) صفحه برگه اطلاعات ایمنی.پروتئین ها از سلول های BV2 یا اگزوزوم های مشتق شده از BV2 جدا شدند.الگوهای پروتئین بین سلول ها و اگزوزوم ها متفاوت است.(ب) تجزیه و تحلیل وسترن بلات یک نشانگر اگزوزومی (Alix).(C) ارزیابی RNA خالص شده از سلول های BV2 و اگزوزوم های مشتق شده از BV2 با استفاده از یک بیوانالایزر.بنابراین، زیر واحدهای ریبوزومی 18S و 28S در سلول‌های BV2 به ندرت در RNA اگزوزومی یافت شدند.(D) میکروسکوپ الکترونی عبوری نشان داد که اگزوزوم‌های جدا شده از سلول‌های BV2 با اورانیل استات 2 درصد رنگ‌آمیزی منفی داشتند.اگزوزوم ها تقریباً 60-150 نانومتر اندازه و فنجانی شکل دارند (Song and Jung، داده های منتشر نشده).
درونی سازی سلولی اگزوزوم های مشتق از BV2 به سلول های گلیوم انسانی U87 با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال مشاهده شد.اگزوزوم های نشاندار شده با PKH26 در سیتوپلاسم سلول های U87 قرار دارند.هسته ها با DAPI رنگ آمیزی شدند (شکل 2A)، که نشان می دهد اگزوزوم های مشتق شده از BV2 می توانند توسط سلول های میزبان درونی شده و محیط سلول های گیرنده را تحت تأثیر قرار دهند.
درونی سازی اگزوزوم های مشتق از BV2 به سلول های گلیوما U87 و اگزوزوم های مشتق شده از BV2 آلوده به توکسوپلاسما RH باعث تکثیر سلول های گلیوما U87 شد.(الف) اگزوزوم های غرق شده توسط سلول های U87 با میکروسکوپ کانفوکال اندازه گیری شد.سلول های گلیوما U87 با اگزوزوم های نشاندار شده با PKH26 (قرمز) یا بدون کنترل به مدت 24 ساعت انکوبه شدند.هسته ها با DAPI (آبی) رنگ آمیزی شدند و سپس در زیر میکروسکوپ کانفوکال (نوار مقیاس: 10 میکرومتر، x 3000) مشاهده شدند.(B) تکثیر سلولی گلیوما U87 با روش تکثیر سلولی تعیین شد.سلول های گلیوما U87 با اگزوزوم برای مدت زمان مشخص درمان شدند. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P < 0.05 توسط آزمون t Student. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P < 0,05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 با استفاده از آزمون t Student به دست آمد.
پس از تایید درونی‌سازی اگزوزوم‌های مشتق شده از BV2 در سلول‌های گلیوما U87، سنجش تکثیر سلولی را برای بررسی نقش اگزوزوم‌های مشتق شده از توکسوپلاسما مشتق از BV2 در توسعه سلول‌های گلیوم انسانی انجام دادیم.درمان سلول‌های U87 با اگزوزوم‌های سلول‌های BV2 آلوده به T. gondii نشان داد که اگزوزوم‌های مشتق شده از BV2 آلوده به T. gondii باعث تکثیر قابل‌توجهی سلول‌های U87 در مقایسه با شاهد شد (شکل 2B).
علاوه بر این، رشد سلول‌های U118 نتایج مشابهی با U87 داشت، زیرا اگزوزوم‌های تحریک‌شده توکسوپلاسما باعث بالاترین سطوح تکثیر شدند (داده‌ها نشان داده نشده است).بر اساس این داده ها، می توان نشان داد که اگزوزوم های آلوده به توکسوپلاسما مشتق از BV2 نقش مهمی در تکثیر سلول های گلیوم ایفا می کنند.
برای بررسی اثر اگزوزوم‌های مشتق از BV2 آلوده به توکسوپلاسما بر رشد تومور، سلول‌های گلیوما U87 را برای مدل زنوگرافت به موش‌های برهنه تزریق کردیم و اگزوزوم‌های مشتق از BV2 یا اگزوزوم‌های مشتق از BV2 آلوده به RH را تزریق کردیم.پس از آشکار شدن تومورها پس از 1 هفته، هر گروه آزمایشی 5 تایی بر اساس اندازه تومور برای تعیین نقطه شروع یکسان تقسیم شدند و اندازه تومور به مدت 22 روز اندازه‌گیری شد.
در موش‌های دارای مدل بیگانه‌گرافت U87، اندازه و وزن تومور به‌طور قابل‌توجهی در گروه اگزوزوم آلوده به RH مشتق از BV2 در روز 22 مشاهده شد (شکل 3A,B).از سوی دیگر، تفاوت معنی داری در اندازه تومور بین گروه اگزوزوم مشتق شده از BV2 و گروه کنترل پس از درمان اگزوزوم وجود نداشت.علاوه بر این، موش‌های تزریق شده با سلول‌های گلیوما و اگزوزوم‌ها به‌طور بصری بیشترین حجم تومور را در گروه اگزوزوم‌های مشتق شده از BV2 آلوده به RH نشان دادند (شکل 3C).این نتایج نشان می‌دهد که اگزوزوم‌های آلوده به توکسوپلاسما مشتق از BV2 باعث رشد گلیوم در مدل تومور موش می‌شوند.
انکوژنز (AC) اگزوزوم های مشتق شده از BV2 در مدل موش زنوگرافت U87.اندازه تومور (A) و وزن (B) در موش‌های برهنه BALB/c تحت درمان با اگزوزوم‌های آلوده به RH مشتق‌شده از BV2 به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافت.موش برهنه BALB/c (C) به صورت زیر جلدی با 1×107 سلول U87 معلق در مخلوط ماتریژل تزریق شد.شش روز پس از تزریق، 100 میکروگرم از اگزوزوم های مشتق شده از BV2 در موش ها تحت درمان قرار گرفتند.اندازه و وزن تومور به ترتیب در روزهای مشخص شده و پس از کشتار اندازه گیری شد. *P <0.05. *P <0.05. *Р <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р <0.05. *P <0.05.
داده ها نشان داد که 37 miRNA (16 با بیان بیش از حد و 21 با بیان کم) مرتبط با ایمنی یا توسعه تومور به طور قابل توجهی در میکروگلیا پس از عفونت با سویه توکسوپلاسما RH تغییر یافته است (شکل 4A).سطح بیان نسبی miR-21 در میان miRNA های تغییر یافته توسط RT-PCR بلادرنگ در اگزوزوم های مشتق شده از BV2، اگزوزوم های تیمار شده با سلول های BV2 و U87 تایید شد.بیان miR-21 افزایش قابل توجهی در اگزوزوم های سلول های BV2 آلوده به توکسوپلاسما گوندی (سویه RH) نشان داد (شکل 4B).سطوح بیان نسبی miR-21 در سلول های BV2 و U87 پس از جذب اگزوزوم های تغییر یافته افزایش یافت (شکل 4B).سطوح نسبی بیان miR-21 در بافت های مغزی بیماران تومور و موش های آلوده به توکسوپلاسما گوندی (سویه ME49) به ترتیب بالاتر از گروه کنترل بود (شکل 4C).این نتایج با تفاوت بین سطوح بیان microRNA های پیش بینی شده و تایید شده در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی ارتباط دارد.
تغییرات در بیان اگزوزوم miP-21a-5p در میکروگلیاهای آلوده به توکسوپلاسما گوندی (RH).(الف) تغییرات قابل توجهی را در siRNA مرتبط با ایمنی یا توسعه تومور به دنبال عفونت T. gondii RH نشان می دهد.(B) سطوح بیان نسبی miR-21 توسط RT-PCR بلادرنگ در اگزوزوم های مشتق شده از BV2، اگزوزوم های تحت درمان با BV2 و سلول های U87 شناسایی شد.(C) سطوح بیان نسبی miR-21 در بافت مغز بیماران تومور (N = 3) و موش های آلوده به Toxoplasma gondii (سویه ME49) (N = 3) یافت شد. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P < 0,05 было получено со помощью t-criteriя Стьюдента. *P<0.05 با استفاده از آزمون t Student به دست آمد. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 با استفاده از آزمون t Student به دست آمد.
اگزوزوم های سلول های BV2 آلوده به RH منجر به رشد گلیوما در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی شد (شکل 2، 3).برای شناسایی mRNA های مربوطه، سطوح mRNA ژن های هدف ضد تومور، جعبه پیشانی O1 (FoxO1)، PTEN، و مرگ سلولی برنامه ریزی شده 4 (PDCD4) را در سلول های U87 آلوده به اگزوزوم های مشتق شده از BV2 یا RH BV2 بررسی کردیم.تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک نشان داده است که چندین ژن مرتبط با تومور، از جمله ژن‌های FoxO1، PTEN و PDCD4، دارای مکان‌های اتصال miR-2121،22 هستند.سطوح mRNA ژن های هدف ضد تومور در اگزوزوم های مشتق از BV2 آلوده به RH در مقایسه با اگزوزوم های مشتق شده از BV2 کاهش یافت (شکل 5A).FoxO1 کاهش سطح پروتئین را در اگزوزوم های مشتق از BV2 آلوده به RH در مقایسه با اگزوزوم های مشتق شده از BV2 نشان داد (شکل 5B).بر اساس این نتایج، ما می‌توانیم تأیید کنیم که اگزوزوم‌های مشتق شده از BV2 آلوده به RH، ژن‌های ضد انکوژن را تنظیم می‌کنند و نقش آن‌ها را در رشد تومور حفظ می‌کنند.
اگزوزوم های مشتق شده از BV2 آلوده به توکسوپلاسما، ژن های ضد تومور را در سلول های گلیوما U87 توسط اگزوزوم های مشتق شده از BV2 آلوده به توکسوپلاسما RH القا می کنند.(الف) PCR بلادرنگ بیان FoxO1، PTEN و PDCD4 در اگزوزوم های مشتق شده از BV2 آلوده به RH T. gondii در مقایسه با اگزوزوم های PBS.β-اکتین mRNA به عنوان شاهد استفاده شد.(B) بیان FoxO1 با وسترن بلات تعیین شد و داده‌های چگالی سنجی با استفاده از برنامه ImageJ مورد ارزیابی آماری قرار گرفتند. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P<0.05 با آزمون t Student به دست آمد. *P < 0,05 было получено со помощью t-criteriя Стьюдента. *P<0.05 با استفاده از آزمون t Student به دست آمد. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 با استفاده از آزمون t Student به دست آمد.
برای درک اثر miP-21 در اگزوزوم ها بر تنظیم ژن مرتبط با تومور، سلول های U87 با یک مهار کننده miP-21 با استفاده از Lipofectamine 2000 ترانسفکت شدند و سلول ها 24 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند.سطوح بیان FoxO1 و p27 در سلول های ترانسفکت شده با مهارکننده های miR-21 با سلول های تیمار شده با اگزوزوم های مشتق از BV2 با استفاده از qRT-PCR مقایسه شد (شکل 6A,B).انتقال مهارکننده miR-21 به سلول های U87 به طور قابل توجهی بیان FoxO1 و p27 را کاهش داد (شکل 6).
miP-21 مشتق از BV2 اگزوزومی آلوده به RH بیان FoxO1/p27 را در سلول های گلیوما U87 تغییر داد.سلول‌های U87 با استفاده از لیپوفکتامین 2000 با مهارکننده miP-21 ترانسفکت شدند و سلول‌ها 24 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند.سطح بیان FoxO1 و p27 در سلول‌های ترانسفکت شده با مهارکننده‌های miR-21 با سطوح سلول‌های تیمار شده با اگزوزوم‌های مشتق از BV2 با استفاده از qRT-PCR (A, B) مقایسه شد.
برای فرار از پاسخ ایمنی میزبان، انگل توکسوپلاسما به یک کیست بافتی تبدیل می شود.آنها بافت های مختلف از جمله مغز، قلب و ماهیچه های اسکلتی را در طول عمر میزبان انگلی می کنند و پاسخ ایمنی میزبان را تعدیل می کنند.علاوه بر این، آنها می توانند چرخه سلولی و آپوپتوز سلول های میزبان را تنظیم کرده و تکثیر آنها را تقویت کنند.توکسوپلاسما گوندی عمدتاً سلول‌های دندریتیک میزبان، نوتروفیل‌ها و دودمان مونوسیت/ماکروفاژ، از جمله میکروگلیاهای مغز را آلوده می‌کند.توکسوپلاسما گوندی باعث تمایز ماکروفاژهای فنوتیپ M2 می شود، بر بهبود زخم پس از عفونت پاتوژن تأثیر می گذارد و همچنین با هیپرواسکولاریزاسیون و فیبروز گرانولوماتوز همراه است.این پاتوژنز رفتاری عفونت توکسوپلاسما ممکن است با نشانگرهای مرتبط با رشد تومور مرتبط باشد.محیط خصمانه تنظیم شده توسط توکسوپلاسما ممکن است شبیه پیش سرطان مربوطه باشد.بنابراین، می توان فرض کرد که عفونت توکسوپلاسما باید به توسعه تومورهای مغزی کمک کند.در واقع، میزان بالای عفونت توکسوپلاسما در سرم بیماران مبتلا به انواع تومورهای مغزی گزارش شده است.علاوه بر این، توکسوپلاسما گوندی ممکن است یکی دیگر از عوامل سرطان زا باشد و به طور هم افزایی برای کمک به سایر سرطان زاهای عفونی در ایجاد تومورهای مغزی عمل کند.در این راستا، شایان ذکر است که P. falciparum و ویروس Epstein-Barr به طور هم افزایی در تشکیل لنفوم Burkitt کمک می کنند.
نقش اگزوزوم ها به عنوان تنظیم کننده در زمینه تحقیقات سرطان به طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است.با این حال، نقش اگزوزوم ها بین انگل ها و میزبان های آلوده به خوبی شناخته نشده است.تاکنون، تنظیم‌کننده‌های مختلف، از جمله پروتئین‌های ترشح‌شده، فرآیندهای بیولوژیکی را توضیح داده‌اند که انگل‌های تک یاخته‌ای در مقابل حمله میزبان مقاومت می‌کنند و عفونت را تداوم می‌بخشند.اخیراً، یک مفهوم رو به رشد وجود داشته است که میکرووزیکول‌های مرتبط با تک یاخته‌ها و microRNAهای آنها با سلول‌های میزبان تعامل می‌کنند تا محیطی مطلوب برای بقای خود ایجاد کنند.بنابراین، مطالعات بیشتری برای کشف رابطه بین miRNA های اگزوزومی تغییر یافته و تکثیر سلول های گلیوما مورد نیاز است.تغییر میکروRNA (ژن‌های خوشه‌ای miR-30c-1، miR-125b-2، miR-23b-27b-24-1 و miR-17-92) به پروموتر STAT3 در ماکروفاژهای انسانی آلوده به توکسوپلاسما متصل می‌شود، تنظیم می‌شود و ضد آپوپتوز در پاسخ به عفونت توکسوپلاسما گوندی 29.عفونت توکسوپلاسما بیان miR-17-5p و miR-106b-5p را افزایش می دهد، که با چندین بیماری پرولیفراتیو مرتبط هستند 30 .این داده ها نشان می دهد که miRNA های میزبان تنظیم شده توسط عفونت توکسوپلاسما، مولکول های مهمی برای بقای انگل و پاتوژنز در رفتار بیولوژیکی میزبان هستند.
miRNA های تغییر یافته می توانند انواع مختلفی از رفتار را در طول شروع و پیشرفت سلول های بدخیم از جمله گلیوم ها تحت تاثیر قرار دهند: خودکفایی سیگنال های رشد، عدم حساسیت به سیگنال های بازدارنده رشد، فرار آپوپتوز، پتانسیل تکرار نامحدود، رگ زایی، تهاجم و متاستاز و التهاب.در گلیوما، miRNA های تغییر یافته در چندین مطالعه پروفایل بیان شناسایی شده اند.
در مطالعه حاضر، ما سطوح بالای بیان miRNA-21 را در سلول‌های میزبان آلوده به توکسوپلاسما تأیید کردیم.miR-21 به‌عنوان یکی از رایج‌ترین microRNA‌هایی که بیش از حد بیان می‌شوند در تومورهای جامد، از جمله گلیوم‌ها، شناسایی شده است، 33 و بیان آن با درجه گلیوما ارتباط دارد.شواهد انباشته نشان می دهد که miR-21 یک انکوژن جدید است که به عنوان یک عامل ضد آپوپتوز در رشد گلیوما عمل می کند و در بافت ها و پلاسمای بدخیمی های مغز انسان به شدت بیان می شود.جالب توجه است که غیرفعال شدن miR-21 در سلول‌ها و بافت‌های گلیوما باعث مهار تکثیر سلولی به دلیل آپوپتوز وابسته به کاسپاز می‌شود.تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک اهداف پیش‌بینی‌شده miR-21 ژن‌های سرکوب‌کننده تومور متعدد مرتبط با مسیرهای آپوپتوز، از جمله مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده 4 (PDCD4)، تروپومیوزین (TPM1)، PTEN و جعبه پیشانی O1 (FoxO1) را با محل اتصال miR-2121 نشان داد..22.38.
FoxO1 به عنوان یکی از فاکتورهای رونویسی (FoxO) در ایجاد انواع مختلف سرطان انسان نقش دارد و می تواند بیان ژن های سرکوبگر تومور مانند p21، p27، Bim و FasL40 را تنظیم کند.FoxO1 می تواند مهارکننده های چرخه سلولی مانند p27 را برای سرکوب رشد سلولی متصل و فعال کند.علاوه بر این، FoxO1 یک عامل کلیدی سیگنال‌دهی PI3K/Akt است و بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی مانند پیشرفت چرخه سلولی و تمایز سلولی را از طریق فعال‌سازی رونویسی p2742 تنظیم می‌کند.
در نتیجه، ما معتقدیم که miR-21 اگزوزومی مشتق شده از میکروگلیاهای آلوده به توکسوپلاسما ممکن است نقش مهمی را به عنوان تنظیم کننده رشد سلول های گلیوم ایفا کند (شکل 7).با این حال، مطالعات بیشتری برای یافتن ارتباط مستقیم بین miR-21 اگزوزومی، عفونت تغییر یافته توکسوپلاسما و رشد گلیوما مورد نیاز است.انتظار می رود این نتایج نقطه شروعی برای مطالعه ارتباط بین عفونت توکسوپلاسما و بروز گلیوما باشد.
یک نمودار شماتیک از مکانیسم سرطان زایی گلیوما (مغز) در این مطالعه پیشنهاد شده است.نویسنده در پاورپوینت 2019 (مایکروسافت، ردموند، WA) طراحی می کند.
تمام پروتکل‌های آزمایشی در این مطالعه، از جمله استفاده از حیوانات، مطابق با دستورالعمل‌های اخلاقی استاندارد کمیته کاربر و مراقبت از حیوانات دانشگاه ملی سئول بود و توسط هیئت بررسی نهادی دانشکده پزشکی دانشگاه ملی سئول (شماره IRB SNU-) تأیید شد. 150715).-2).تمام مراحل آزمایشی مطابق با توصیه های ARRIVE انجام شد.
میکروگلیاهای موش BV2 و سلول‌های گلیوم انسانی U87 به ترتیب در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM؛ Welgene، سئول، کره) و محیط موسسه Roswell Park Memorial (RPMI؛ Welgene)، هر کدام حاوی 10٪ سرم جنین گاوی، 4 میلی‌مولار کشت داده شدند. گلوتامین، 0.2 میلی مولار پنی سیلین و 0.05 میلی مولار استرپتومایسین.سلول ها در انکوباتور با 5% CO2 در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند.رده سلولی گلیوما دیگر، U118، برای مقایسه با سلول های U87 استفاده شد.
برای جداسازی اگزوزوم‌ها از سویه‌های RH و ME49 آلوده به T. gondii، تاکی زوئیت‌های T. gondii (سویه RH) از حفره شکمی موش‌های BALB/c 6 هفته‌ای که 3-4 روز قبل تزریق شده بودند، برداشت شدند.تاکی زوئیت ها سه بار با PBS شسته و با سانتریفیوژ در 40% پرکول (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43 خالص شدند.برای به دست آوردن تاکی زوئیت های سویه ME49، به موش های BALB/c 20 کیست بافتی به صورت داخل صفاقی تزریق شد و تبدیل تاکی زوئیت در کیست ها با شستشوی حفره شکمی در روز 6-8 پس از عفونت جمع آوری شد.موش های آلوده به PBSتاکیزوئیت‌های ME49 در سلول‌های حاوی 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر پنی‌سیلین (Gibco/BRL، گراند آیلند، نیویورک، ایالات متحده آمریکا)، 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر استرپتومایسین (Gibco/BRL)، و 5 درصد سرم جنین گاوی (Lonza، Walkersville، MD) رشد کردند. ..، ایالات متحده آمریکا) در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد دی اکسید کربن.پس از کشت در سلول‌های Vero، تاکی‌زوئیت‌های ME49 دو بار از طریق یک سوزن گیج 25 و سپس از فیلتر 5 میکرومتری عبور داده شدند تا بقایای و سلول‌ها حذف شوند.پس از شستشو، تاکی زوئیت ها در PBS44 معلق شدند.کیست های بافتی سویه ME49 توکسوپلاسما گوندی با تزریق داخل صفاقی کیست های جدا شده از مغز موش های آلوده C57BL/6 (مرکز Orient Bio Animal، Seongnam، کره) حفظ شد.مغز موش‌های آلوده به ME49 پس از 3 ماه PI جمع‌آوری شد و برای جداسازی کیست‌ها در زیر میکروسکوپ خرد شد.موش‌های آلوده تحت شرایط ویژه عاری از پاتوژن (SPF) در دانشکده پزشکی دانشگاه ملی سئول نگهداری شدند.
RNA کل از اگزوزوم‌های مشتق شده از BV2، سلول‌ها و بافت‌های BV2 با استفاده از کیت miRNeasy Mini (Qiagen، Hilden، آلمان) مطابق دستورالعمل‌های سازنده، از جمله زمان انکوباسیون برای مرحله شستشو استخراج شد.غلظت RNA در دستگاه اسپکتروفتومتر NanoDrop 2000 تعیین شد.کیفیت ریزآرایه‌های RNA با استفاده از یک بیوانالایزر Agilent 2100 (Agilent Technologies، Amstelveen، هلند) ارزیابی شد.
DMEM با 10% FBS فقیر از اگزوزوم توسط اولتراسانتریفیوژ در 100000 گرم به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد تهیه شد و از طریق یک فیلتر 0.22 میکرومتر (Nalgene, Rochester, NY, USA) فیلتر شد.سلول های BV2، 5 × 105، در DMEM حاوی 10٪ FBS فاقد اگزوزوم و 1٪ آنتی بیوتیک در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5٪ CO2 کشت داده شدند.پس از 24 ساعت انکوباسیون، تاکی‌زوئیت‌های سویه RH یا ME49 (MOI = 10) به سلول‌ها اضافه شدند و انگل‌های غیر مهاجم در عرض یک ساعت حذف شدند و دوباره با DMEM پر شدند.اگزوزوم‌های سلول‌های BV2 با سانتریفیوژ دیفرانسیل اصلاح‌شده، پرکاربردترین روش، جداسازی شدند.گلوله اگزوزوم را در 300 میکرولیتر PBS برای آنالیز RNA یا پروتئین معلق کنید.غلظت اگزوزوم های جدا شده با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) و اسپکتروفتومتر NanoDrop 2000 تعیین شد.
رسوبات سلول‌های BV2 یا اگزوزوم‌های مشتق‌شده از BV2 در محلول استخراج پروتئین PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology، Seongnam، کره) لیز شدند و پروتئین‌ها روی ژل‌های پلی آکریل آمید 10% SDS آبی رنگ‌آمیزی Coomassie بارگذاری شدند.علاوه بر این، پروتئین ها به مدت 2 ساعت به غشاهای PVDF منتقل شدند.وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) به عنوان یک نشانگر اگزوزومی تأیید شد.IgG ضد موش بز کونژوگه HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) و یک تحلیلگر تصویر شب تاب LAS-1000 به علاوه (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) به عنوان آنتی بادی ثانویه استفاده شد..میکروسکوپ الکترونی عبوری برای بررسی اندازه و مورفولوژی اگزوزوم ها انجام شد.اگزوزوم های جدا شده از سلول های BV2 (40/6 میکروگرم بر میکرولیتر) روی مش های پوشش داده شده با کربن تهیه و به مدت 1 دقیقه با اورانیل استات 2 درصد رنگ آمیزی منفی شدند.نمونه های آماده شده در ولتاژ شتاب دهنده 80 کیلو ولت با استفاده از JEOL 1200-EX II (توکیو، ژاپن) مجهز به دوربین CCD Erlangshen ES1000W (Gatan، Pleasanton، CA، USA) مشاهده شدند.
اگزوزوم های مشتق شده از BV2 با استفاده از کیت پیوند دهنده فلورسنت قرمز PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند.سلول های U87، 2×105، با اگزوزوم های نشاندار شده با PKH26 (قرمز) یا بدون اگزوزوم به عنوان کنترل منفی، در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت در انکوباتور CO2 5 درصد انکوبه شدند.هسته های سلول U87 با DAPI (آبی) رنگ آمیزی شدند، سلول های U87 در پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد ثابت شدند و سپس در سیستم میکروسکوپ کانفوکال Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems، Mannheim، آلمان) آنالیز شدند.قابل مشاهده
cDNA از siRNA با استفاده از سنتز رشته اول Mir-X siRNA و کیت QRT-PCR SYBR (Takara Bio Inc.، Shiga، ژاپن) سنتز شد.PCR کمی با زمان واقعی با استفاده از سیستم تشخیص واقعی PCR iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) با استفاده از پرایمرها و الگوهای مخلوط با SYBR Premix انجام شد.DNA برای 40 چرخه دناتوراسیون در 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه و بازپخت در 60 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه تکثیر شد.داده های هر واکنش PCR با استفاده از ماژول تجزیه و تحلیل داده های نرم افزار سیستم نوری iQ™5 (Bio-Rad) تجزیه و تحلیل شد.تغییرات نسبی در بیان ژن بین ژن‌های هدف انتخاب شده و β-اکتین/siRNA (و U6) با استفاده از روش منحنی استاندارد محاسبه شد.توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است.
3 × 104 سلول گلیوما U87 در صفحات 96 چاهی کاشته شدند و با اگزوزوم های آلوده به توکسوپلاسما مشتق از BV2 (50 میکروگرم بر میلی لیتر) یا اگزوزوم های غیر پالس مشتق شده از BV2 (50 میکروگرم در میلی لیتر) به عنوان شاهد در 12، 18 و 36 ساعت مخلوط شدند. .سرعت تکثیر سلولی با استفاده از کیت شمارش سلولی-8 (دوجیندو، کوماموتو، ژاپن) تعیین شد (شکل های تکمیلی S1-S3) 46.
موش های برهنه ماده 5 هفته ای BALB/c از Orient Bio (Seongnam-si، کره جنوبی) خریداری شدند و به صورت جداگانه در قفس های استریل در دمای اتاق (2±22 درجه سانتی گراد) و رطوبت (15±45 درجه سانتی گراد) نگهداری شدند.درصد در دمای اتاق (2±22 درجه سانتیگراد) و رطوبت (15±45 درصد).یک چرخه نوری 12 ساعته و یک چرخه تاریکی 12 ساعته تحت SPF (مرکز حیوانات دانشکده پزشکی دانشگاه ملی سئول) انجام شد.موش ها به طور تصادفی به سه گروه 5 تایی تقسیم شدند و به همه گروه ها 400 میلی لیتر PBS حاوی 1×107 سلول گلیوما U87 و فاکتور رشد کاهش دهنده BD Matrigel™ به صورت زیر جلدی تزریق شد (BD Science, Miami, FL, USA).شش روز پس از تزریق تومور، 200 میلی گرم اگزوزوم مشتق شده از سلول های BV2 (با/بدون عفونت توکسوپلاسما) به محل تومور تزریق شد.بیست و دو روز پس از عفونت تومور، اندازه تومور موش‌های هر گروه سه بار در هفته با کولیس اندازه‌گیری شد و حجم تومور با فرمول: 0.5×(عرض)×2×طول محاسبه شد.
تجزیه و تحلیل بیان MicroRNA با استفاده از آرایه miRNA miRNA LNA miRCURYTM، نسل هفتم دارای آرایه‌های mmu و rno (EXIQON، Vedbaek، دانمارک) است که 1119 موش با ویژگی‌های خوب را در بین 3100 کاوشگر جذب miRNA انسان، موش و موش پوشش می‌دهد.در طی این روش، 250 تا 1000 نانوگرم از RNA کل از 5'-فسفات با تیمار با آلکالین فسفاتاز روده گوساله و سپس برچسب‌گذاری با رنگ فلورسنت سبز Hy3 حذف شد.سپس نمونه‌های برچسب‌گذاری شده با بارگذاری لام‌های ریزآرایه با استفاده از کیت محفظه هیبریداسیون (Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) و یک کیت اسلاید هیبریداسیون (Agilent Technologies) هیبرید شدند.هیبریداسیون به مدت 16 ساعت در دمای 56 درجه سانتی گراد انجام شد، سپس ریزآرایه ها مطابق با توصیه های سازنده شسته شدند.اسلایدهای ریزآرایه پردازش شده سپس با استفاده از یک سیستم اسکنر ریزآرایه Agilent G2565CA (تکنولوژی های Agilent) اسکن شدند.تصاویر اسکن شده با استفاده از نرم افزار Agilent Feature Extraction نسخه 10.7.3.1 (Agilent Technologies) وارد شدند و شدت فلورسانس هر تصویر با استفاده از فایل GAL مربوطه پروتکل اصلاح شده Exiqon اندازه گیری شد.داده های ریزآرایه برای مطالعه فعلی در پایگاه داده GEO با شماره دسترسی GPL32397 سپرده شده است.
پروفایل های بیان miRNA های اگزوزومی بالغ در میکروگلیا سویه های RH یا ME49 آلوده به توکسوپلاسما با استفاده از ابزارهای مختلف شبکه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.miRNA های مرتبط با توسعه تومور با استفاده از miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) شناسایی شدند و با شدت سیگنال نرمال شده (log2) بیشتر از 8.0 فیلتر شدند.در میان miRNA‌ها، miRNA‌هایی که با بیان متفاوت بیان می‌شوند، بیش از 1.5 برابر با تجزیه و تحلیل فیلتر miRNA‌های تغییر یافته توسط سویه‌های RH یا ME49 آلوده به T. gondii تغییر یافته‌اند.
سلول ها در صفحات شش چاهی (3×105 سلول در چاه) در opti-MEM (Gibco، Carlsbad، CA، USA) با استفاده از Lipofectamine 2000 (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) کاشته شدند.سلول های ترانسفکت شده به مدت 6 ساعت کشت داده شدند و سپس محیط به محیط کامل تازه تبدیل شد.سلول ها 24 ساعت پس از ترانسفکشن برداشت شدند.
تجزیه و تحلیل آماری عمدتاً با استفاده از آزمون t Student با نرم افزار Excel (Microsoft, Washington, DC, USA) انجام شد.برای تجزیه و تحلیل حیوانات تجربی، یک ANOVA دو طرفه با استفاده از نرم افزار Prism 3.0 (نرم افزار GraphPad، La Jolla، CA، USA) انجام شد. P-value < 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. مقادیر P<0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. مقادیر P<0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义. P<0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. مقادیر P<0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.
تمام پروتکل‌های تجربی مورد استفاده در این مطالعه توسط هیئت بازبینی نهادی دانشکده پزشکی دانشگاه ملی سئول (شماره IRB SNU-150715-2) تأیید شد.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley، J. و همکاران.برآورد وقوع سرطان و مرگ و میر جهانی در سال 2018: منابع و روش های GLOBOCAN.تفسیر.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
راشد، س.، رحمان، ک. و آکاش، ام اس بینشی در مورد عوامل خطر تومورهای مغزی و مداخلات درمانی آنها. راشد، س.، رحمان، ک. و آکاش، ام اس بینشی در مورد عوامل خطر تومورهای مغزی و مداخلات درمانی آنها.راشد، س.، رحمان، ک. و آکاش، ام اس مروری بر عوامل خطر برای تومورهای مغزی و مداخلات عمده درمانی. رشید، اس.، رحمان، ک. و آکاش، ام اس 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS درک عمیق عوامل خطر تومور مغزی و مداخلات درمانی.راشد، س.، رحمان، ک. و آکاش، ام اس مروری بر عوامل خطر برای تومورهای مغزی و مداخلات عمده درمانی.علم پزشکی.داروساز.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. تعاملات باکتریایی-ویروسی در سرطان های دستگاه گوارش انسان و دستگاه تناسلی زنان: خلاصه ای از شواهد اپیدمیولوژیک و آزمایشگاهی. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. تعاملات باکتریایی-ویروسی در سرطان های دستگاه گوارش انسان و دستگاه تناسلی زنان: خلاصه ای از شواهد اپیدمیولوژیک و آزمایشگاهی.Kato I.، Zhang J. و Sun J. تعاملات باکتریایی و ویروسی در سرطان دستگاه گوارش انسان و دستگاه تناسلی زنان: خلاصه ای از داده های اپیدمیولوژیک و آزمایشگاهی. کاتو، آی.، ژانگ، جی و سان، جی. Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. تعامل باکتری و ویروسی در هضم حفره دهان انسان و دستگاه تناسلی زنان: خلاصه ای از علم بیماری های رایج و شواهد آزمایشگاهی.Kato I.، Zhang J. و Sun J. تعاملات باکتریایی-ویروسی در سرطان دستگاه گوارش انسان و سرطان دستگاه تناسلی زنان: خلاصه ای از داده های اپیدمیولوژیک و آزمایشگاهی.سرطان 14، 425 (2022).
Magon، KL & Parish، JL از عفونت تا سرطان: چگونه ویروس‌های تومور DNA، کربن مرکزی و متابولیسم لیپید سلول میزبان را تغییر می‌دهند. Magon، KL & Parish، JL از عفونت تا سرطان: چگونه ویروس‌های تومور DNA، کربن مرکزی و متابولیسم لیپید سلول میزبان را تغییر می‌دهند.Mahon، KL و Parish، JL عفونت آتش به سرطان: چگونه ویروس های تومور مبتنی بر DNA، کربن مرکزی و متابولیسم لیپید سلول میزبان را تغییر می دهند. Magon، KL & Parish، JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代 Magon، KL & Parish، JL از عفونت تا سرطان: چگونه ویروس‌های تومور DNA، کربن مرکزی و متابولیسم لیپید سلول میزبان را تغییر می‌دهند.Mahon، KL و Parish، JL عفونت را به سرطان منتقل می کند: چگونه ویروس های تومور DNA متابولیسم مرکزی کربن و لیپید را در سلول های میزبان تغییر می دهند.زیست شناسی باز11, 210004 (2021).
Correia da Costa، ​​JM و همکاران.استروژن های کاتکول شیستوزوم ها و فلوک های کبد و سرطان مرتبط با کرم.جلوداخل گرم5, 444 (2014).