ژیاردیا اثنی عشر یک ارگانیسم انگلی است که باعث ژیاردیازیس می شود، یک عفونت روده ای به ویژه در کودکان خردسال با علائم بالینی اسهال شایع است.ما قبلا گزارش کرده‌ایم که G. duodenalis خارج سلولی باعث فعال‌سازی نوکلئوتیدهای اتصال گیرنده 3 (NLRP3) شبه الیگومریزاسیون داخل سلولی می‌شود و پاسخ‌های التهابی میزبان را از طریق ترشح وزیکول خارج سلولی (EV) تنظیم می‌کند.با این حال، الگوهای مولکولی دقیق EV دئودنوکوک مرتبط با پاتوژن (GEV) درگیر در این فرآیند و نقش التهاب NLRP3 در ژیاردیازیس باقی مانده است که مشخص شود.
پلاسمیدهای بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1 (+) -alpha-2 و ژیاردین آلفا-7.3 در GEV ساخته شدند، به ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش ترانسفکت شدند و با اندازه‌گیری مولکول هدف التهاب کاسپاز-1 شناسایی شدند.سطح بیان p20 غربال شد..G. duodenalis آلفا-2 و آلفا-7.3 ژیاردین ها در ابتدا با اندازه گیری NLRP3 التهابی (NLRP3، پرو-اینترلوکین-1 بتا [IL-1β]، پرو-کاسپاز-1 و کاسپاز-1 p20)، ترشح IL شناسایی شدند.سطوح 1β، سطوح الیگومریزاسیون پروتئین خالدار آپوپتوز (ASC)، و محلی سازی ایمونوفلورسانس NLRP3 و ASC.نقش التهاب NLRP3 در بیماری‌زایی G. duodenalis با استفاده از موش‌هایی که در آن‌ها فعال‌سازی NLRP3 مسدود شده بود (موش‌های NLRP3 مسدود شده) و تغییرات پاتولوژیک در وزن بدن، بار انگلی اثنی‌عشر و بافت دوازدهه بررسی شد.علاوه بر این، ما بررسی کردیم که آیا هیاردین‌های آلفا-2 و آلفا-7.3 باعث ترشح IL-1β در داخل بدن از طریق التهاب NLRP3 می‌شوند و نقش این مولکول‌ها را در بیماری‌زایی G. duodenalis در موش تعیین کردیم.
ژیاردین های آلفا-2 و آلفا-7.3 فعال شدن NLRP3 التهابی را در شرایط آزمایشگاهی القا می کنند.این منجر به فعال شدن p20 کاسپاز-1، افزایش سطح بیان پروتئین های NLRP3، pro-IL-1β و pro-caspase-1، افزایش قابل توجهی در ترشح IL-1β، تشکیل لکه های ASA در سیتوپلاسم و القای الیگومریزاسیون ASAالتهاب NLRP3 از دست دادن آلت تناسلی باعث تشدید بیماری زایی G. duodenalis در موش می شود.موش‌های تحت درمان با کیست‌ها با گاواژ از موش‌های مسدود شده با NLRP3، تعداد بیشتری از تروفوزوئیت‌ها و آسیب شدید به پرزهای اثنی عشر را نشان دادند، که مشخصه آن کریپت‌های نکروزه با منقبض شدن و انشعاب بود.آزمایش‌های in vivo نشان داده‌اند که ژیاردین‌های آلفا-2 و آلفا-7.3 می‌توانند ترشح IL-1β را از طریق التهاب NLRP3 القاء کنند و ایمن‌سازی با ژیاردین‌های آلفا-2 و آلفا-7.3 باعث کاهش بیماری‌زایی G. duodenalis در موش‌ها شد.
در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که ژیاردیا آلفا-2 و آلفا-7.3 باعث کاهش التهاب NLRP3 میزبان و کاهش عفونت‌زایی G. duodenalis در موش‌ها می‌شود که اهداف امیدوارکننده‌ای برای پیشگیری از ژیاردیازیس هستند.
ژیاردیا اثنی عشر یک انگل تک یاخته ای خارج سلولی است که در روده کوچک زندگی می کند و سالانه باعث ۲۸۰ میلیون مورد ژیاردیازیس همراه با اسهال می شود، به ویژه در میان کودکان در کشورهای در حال توسعه [۱].افراد با نوشیدن آب یا غذای آلوده به کیست M. duodenum آلوده می شوند که سپس وارد معده شده و در شیره معده دفع می شود.تروفوزوئیت های ژیاردیا اثنی عشر به اپیتلیوم دوازدهه متصل می شوند و باعث تهوع، استفراغ، اسهال، درد شکم و کاهش وزن می شوند.افراد مبتلا به نقص ایمنی و فیبروز کیستیک مستعد ابتلا به عفونت هستند.عفونت همچنین می تواند از طریق رابطه جنسی دهانی و مقعدی رخ دهد [2].داروهایی مانند مترونیدازول، تینیدازول و نیتازوکسانید گزینه های درمانی ارجح برای عفونت های اثنی عشر هستند [3].با این حال، این داروهای شیمی درمانی باعث عوارض جانبی نامطلوب مانند حالت تهوع، سرطان زایی و سمیت ژنتیکی می شوند [4].بنابراین، استراتژی‌های مؤثرتری برای جلوگیری از عفونت G. duodenalis باید ایجاد شود.
Inflammasomes دسته‌ای از کمپلکس‌های پروتئین سیتوزولی هستند که بخشی از پاسخ ایمنی ذاتی هستند و به دفاع در برابر تهاجم پاتوژن کمک می‌کنند و پاسخ‌های التهابی را واسطه می‌کنند [5].در میان این التهاب‌ها، گیرنده 3 (NLRP3) الیگومریزاسیون متصل شونده به نوکلئوتید (NLRP3) التهاب شبه اتصال به نوکلئوتید به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است، زیرا می‌توان آن را توسط پاتوژن‌ها/الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب شناسایی کرد. DAMP)، سیستم ایمنی ذاتی را تشخیص می دهد، فعال می کند.و هموستاز روده را در بسیاری از بیماری های التهابی تنظیم می کند [6،7،8].این شامل گیرنده تشخیص الگو (PRR) NLRP3، یک پروتئین خالدار آپوپتوز آداپتور (ASC) و یک پروکاسپاز-1 یا پروکاسپاز-11 است.همانطور که در مطالعات Neospora caninum [9]، Paracoccidioides brasiliensis [10] و لیشمانیا مشاهده شد، التهاب NLRP3 به عنوان میزبان در برابر تهاجم پاتوژن عمل می کند.[11]، اما همچنین گزارش شده است که فعال شدن NLRP3 التهابی پاسخ های ایمنی محافظتی را محدود می کند و پیشرفت بیماری را تشدید می کند، به عنوان مثال، در کرم ها [12].بر اساس یافته‌های قبلی، گزارش دادیم که G. duodenalis خارج سلولی باعث فعال‌سازی درون سلولی التهاب NLRP3 می‌شود و پاسخ‌های التهابی میزبان را با ترشح وزیکول‌های خارج سلولی (EVs) تعدیل می‌کند [13].با این حال، نقش التهاب NLRP3 در عفونت G. duodenalis در داخل بدن هنوز مشخص نشده است.
ژیاردین ها در ابتدا به عنوان اجزای ساختاری اسکلت سلولی G. duodenalis توصیف شدند و نقش مهمی در تحرک تروفوزوئیت و اتصال سلول های اپیتلیال در روده کوچک دارند.برای انطباق بهتر با محیط و افزایش بیماری زایی، تروفوزوئیت های G. duodenalis یک ساختار اسکلت سلولی منحصر به فرد متشکل از 8 تاژک، 1 بدن میانی و 1 دیسک شکمی ایجاد کردند [14].تروفوزوئیت های ژیاردیا دوازدهه از اسکلت سلولی خود برای نفوذ به قسمت فوقانی روده کوچک به ویژه دوازدهه استفاده می کنند و به انتروسیت ها متصل می شوند.آنها دائما مهاجرت کرده و با استفاده از متابولیسم سلولی به سلول های اپیتلیال متصل می شوند.بنابراین، رابطه نزدیکی بین اسکلت سلولی و حدت آنها وجود دارد.ژیاردین های مخصوص ژیاردیا دوازدهه اجزای ساختار اسکلت سلولی [15] هستند و به چهار کلاس α-، β-، γ- و δ-ژیاردین ها تقسیم می شوند.21 عضو از خانواده α-ژیاردین وجود دارد که همه آنها توانایی وابسته به کلسیم برای اتصال فسفولیپیدها را دارند [16].آنها همچنین اسکلت سلولی را به غشای سلولی متصل می کنند.در افراد مبتلا به اسهال ناشی از G. duodenalis، α-ژیاردین ها در طول عفونت به شدت بیان می شوند و واکنش ایمنی دارند [17].واکسن‌های هترولوگ مبتنی بر ژیاردیا آلفا-1 در برابر ژیاردیازیس در موش محافظت می‌کنند و آنتی ژن‌های کاندید بالقوه برای ساخت واکسن هستند [18].آلفا-8 ژیاردین، که در غشای پلاسمایی و تاژک‌ها، اما نه در دیسک شکمی، موضعی است، تحرک و سرعت رشد تروفوزوئیت‌ها را در G. duodenalis افزایش می‌دهد [19].آلفا-14 ژیاردین به ساختارهای میکروتوبولی روی تاژک‌ها می‌چسبد و بر زنده‌مانی G. duodenalis تأثیر می‌گذارد [20].آلفا-11 ژیاردین به وفور در طول چرخه زندگی وجود دارد و بیان بیش از حد آلفا-11 ژیاردین به خود G. duodenalis آسیب می رساند [21].با این حال، مشخص نیست که آیا آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین در برابر عفونت G. duodenalis و مکانیسم های زمینه ای آنها محافظت می کنند یا خیر.
در این مطالعه، پلاسمیدهای بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine و pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ژیاردین به ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش ترانسفکت شدند تا NLRP3 میزبان را فعال کنند.سپس اهداف التهابی غربالگری شدند.ما همچنین نقش التهاب NLRP3 را در بیماریزایی G. duodenalis ارزیابی کردیم، بررسی کردیم که آیا ژیاردین های آلفا-2 و آلفا-7،3 باعث فعال شدن التهاب NLRP3 در داخل بدن می شوند، و مشخص کردیم که این دو نقش ژیاردین در بیماری زایی G. duodenalis.هدف مشترک ما ایجاد اهداف امیدوارکننده برای پیشگیری از عفونت G. duodenalis بود.
نوع وحشی (WT) C57BL/6 موش ماده 5 تا 8 هفته ای از مرکز حیوانات آزمایشی لیائونینگ چانگ شنگ (لیائونینگ، چین) خریداری شد.موش ها دسترسی آزاد به آب داشتند، غذای استریل شده دریافت کردند و در چرخه نور/تاریکی 12/12 ساعت نگهداری شدند.قبل از عفونت، موش‌ها آنتی‌بیوتیک‌ها را به صورت آزاد در آب آشامیدنی حاوی آمپی‌سیلین (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، وانکومایسین (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، و نئومایسین (1.4 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) (همه از شانگهای، چین، موجودات مصنوعی خریداری شده دریافت کردند) [22] ].].موش هایی که توانایی خوردن و آشامیدن را برای بیش از 24 ساعت از دست دادند و بیش از 20 درصد وزن بدن خود را از دست دادند به طور انسانی با دررفتگی دهانه رحم کشته شدند.
تروفوزوئیت های WB G. duodenalis (مجموعه کشت نوع آمریکایی، ماناساس، ایالات متحده آمریکا) با 12.5٪ سرم جنین گاو (FBS; Every Green، ژجیانگ، چین) و 0.1٪ صفرا گاوی (Sigma-Aldrich، سنت میسوری، ایالات متحده آمریکا) تکمیل شدند. ).ایالات متحده) در شرایط میکروآروبیک.تروفوزوئیت‌های هم‌ریز روی یخ جمع‌آوری شدند و به نسبت 1:4 برای تولید مثل بیشتر عبور داده شدند.
کیست‌های دئودنوم ژیاردیا همانطور که قبلاً توضیح داده شد [23] القا شدند، تروفوزوئیت‌ها در فاز لگاریتمی برداشت شدند و سپس با محیط القاکننده کپسولاسیون، pH 7.1 (تغییر شده TYI-S-33) تا غلظت نهایی 106 × 1 تروفوزوئیت در میلی‌لیتر رقیق شدند.غلظت صفرا 0.05 درصد متوسط).تروفوزوئیت ها در شرایط بی هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد تا مرحله رشد لگاریتمی کشت داده شدند.محیط را به محیط القا کننده کیست (pH 7.8؛ محیط TYI-S-33 اصلاح شده با غلظت صفرا 1 درصد) تغییر دهید و G. duodenalis را در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 تا 96 ساعت کشت دهید، که طی آن کیست های تشکیل زیر میکروسکوپ مشاهده شدند.پس از اینکه بیشتر تروفوزوئیت ها برای تشکیل کیست القا شدند، مخلوط کشت برداشت شد و در آب استریل دیونیزه شده مجدداً معلق شد تا تروفوزوئیت های باقی مانده لیز شوند.کیست ها شمارش شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد برای تجزیه و تحلیل های بعدی از طریق لوله معده در موش نگهداری شدند.
وزیکول های خارج سلولی ژیاردیا (GEVs) همانطور که قبلاً توضیح داده شد غنی شدند [13].تروفوزوئیت ها در فاز رشد لگاریتمی در محیط اصلاح شده TYI-S-33 تهیه شده با FBS فاقد اگزوزوم (صنایع بیولوژیکی، بیت-همک، اسرائیل) به غلظت نهایی 106×1 انگل در میلی لیتر معلق شدند و به مدت 12 ساعت انکوبه شدند.با سانتریفیوژ کردن در 2000 گرم به مدت 10 دقیقه، 10000 گرم به مدت 45 دقیقه و 100000 گرم به مدت 60 دقیقه از مایع رویی کشت جدا شدند.رسوبات در سالین بافر فسفات (PBS) حل شدند، با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) کمیت شدند و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شدند یا مستقیماً برای آنالیزهای بیشتر مورد استفاده قرار گرفتند.
ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش همانطور که قبلاً توضیح داده شد آماده شدند [24].به طور خلاصه، موش‌ها (8-6 هفته) با 2.5 میلی‌لیتر محیط تیوگلیکول مایع 2.98 درصد Difco (BD، Franklin Lakes، NJ، USA) به صورت داخل صفاقی [IP] تزریق شدند و به 3-4 کام تغذیه شدند.پس از اتانازی، سوسپانسیون ماکروفاژها از حفره شکمی موش ها جمع آوری شد و 3 بار در 1000 گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد.سلول های برداشت شده توسط فلوسیتومتری با استفاده از نشانگر CD11b شناسایی شدند تا زمانی که خلوص سلولی بیش از 98٪ بود، سپس به صفحات کشت سلولی 6 چاهی (4.5 x 106 سلول در چاه) اضافه شدند و با 10٪ FBS (Bioindustry) در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند.و 5% CO2.
RNA از 1 × 107 تروفوزوئیت در 1 میلی لیتر از معرف TRIZol (Vazyme، نانجینگ، چین) استخراج شد، DNA ژنومی از RNA کل G. duodenalis با استفاده از MonScript dsDNase (موناد، ووهان، چین) استخراج شد و DNA مکمل (cDNA) سنتز شد. با استفاده از MonScript RTIIII Super Mix (Monad) طبق دستورالعمل سازنده.
اطلاعات توالی CDS برای ژن هدف G. duodenalis از GenBank NCBI به دست آمد.از Primer 5.0 برای طراحی پرایمرهای شبیه سازی بدون درز خاص برای هر ژن هدف استفاده کنید.پرایمر فوروارد (5'-3') از سه بخش تشکیل شده است: یک توالی همپوشانی با یک بردار خطی pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) و کدون های شروع ATG و GNN (اگر پایه اول G نباشد).این کار برای بهبود کارایی بیان انجام می شود.علاوه بر این، حداقل 16 جفت باز پایه های ترکیبی (محتوای GC 40-60٪/Tm تقریباً 55 درجه سانتیگراد).پرایمر معکوس (5'-3') از دو بخش تشکیل شده است، یک توالی همپوشانی با وکتور pcDNA3.1(+) خطی شده با EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) و یک پایه ترکیبی حداقل 16 جفت باز.(به استثنای دو توقف آخر).بازها) یک کدون مانند AA یا GA که به پلاسمیدهای نوترکیب اجازه می دهد تا پروتئین های نشاندار شده خود را بیان کنند).توالی های آغازگر در جدول 1 فهرست شده اند و توسط Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun، چین) سنتز شده اند.
اهداف با استفاده از Pfu DNA پلیمراز (Tiangen، پکن، چین) یا Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd.، Beijing، چین) با استفاده از cDNA G. duodenalis آماده شده به عنوان یک الگو، تکثیر شدند.پلاسمید ناقل بیان یوکاریوتی pcDNA3.1 (+) با آنزیم محدود کننده EcoRV خطی شد و با استفاده از Fast AP (Thermo Fisher Scientific) دفسفریله شد.قطعات pcDNA3.1(+) خطی شده و قطعات ژن هدف تقویت شده با استفاده از کیت خالص سازی ژل DNA (Tiangen) خالص و با استفاده از Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) اندازه گیری شد.قطعه pcDNA3.1 (+) و هر قطعه ژن هدف با استفاده از مخلوط شبیه‌سازی مونتاژ تک مونتاژ MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) دوباره ترکیب شدند و با توالی‌یابی DNA با استفاده از Comate Bioscience Company Limited (چانگچون، چین) تأیید شدند..
پلاسمیدهای عاری از اندوتوکسین pcDNA3.1(+)-alpha-2 و pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 با استفاده از کیت مینی پلاسمید SanPrep بدون اندوتوکسین (Sangon Biotech) تولید شدند.غلظت بالای 500 نانوگرم در میکرولیتر حفظ شد تا اطمینان حاصل شود که EDTA در بافر شستشو با روش ترانسفکشن تداخلی ندارد.ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش به مدت 12 ساعت در پلیت های 6 چاهی با محیط کامل RPMI 1640 (صنایع بیولوژیک) کشت داده شدند، سپس سلول ها 3 بار در PBS گرم برای حذف پنی سیلین و استرپتومایسین شسته شدند و سپس در محیطی که با محیط کامل تکمیل شد.پلاسمیدهای عاری از اندوتوکسین pcDNA3.1(+)-alpha-2 و pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 میکروگرم) در 125 میکرولیتر از محیط سرمی کاهش یافته Opti-MEM (Gibco، Thermo Fisher Scientific) رقیق شدند..سپس 5 میکرولیتر از معرف ترانسفکشن لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) در 125 میکرولیتر محیط Opti-MEM سرم کم رقیق شد.کمپلکس های لیپوزوم-DNA را با مخلوط کردن پلاسمید بدون اندوتوکسین رقیق شده با لیپوفکتامین 2000 و اجازه دادن به مخلوط به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق آماده کنید.کمپلکس ها را به طور جداگانه به سلول های هر چاهک منتقل کنید و به آرامی مخلوط کنید.پس از 4 ساعت، محیط کشت سلولی با 2 میلی لیتر محیط کامل RPMI 1640 جایگزین شد و کشت به مدت 24 ساعت ادامه یافت.محیط کشت سلولی تازه به سلول‌ها اضافه شد و بسته به طراحی آزمایش برای مقاطع زمانی مختلف انکوبه شد.
نمونه‌های پروتئینی از سوپرناتانت‌ها و لیزات سلولی همانطور که قبلاً توضیح داده شد تهیه شد [25].پارامترهای انتقال غشا برای pro-IL-1β، pro-caspase-1، caspase-1 p20، NLRP3، β-اکتین و His-tag 200 میلی آمپر در 90 دقیقه بود.برای اینترلوکین 1β (IL-1β؛ R&D Systems، مینیاپولیس، مینه سوتا، ایالات متحده آمریکا)، کاسپاز-1 (p20) (Adipogen، سوئیس) و NLRP3 (Adipogen SA، Epalinges، سوئیس) و 1:5000 با هدف قرار دادن برچسب His (Amylet Scientific، ووهان، چین) و β-اکتین (Proteintech، ووهان، چین).
پیوند متقاطع با سابرات دی سوکسینیمید (DSS) همانطور که قبلاً توضیح داده شد [26] انجام شد.سلول ها 3 بار با PBS سرد شسته شدند و به طور کامل با یک سوزن گیج 27 در 50 میکرولیتر بافر واکنش ASC (pH 8.0) حاوی 25 میلی مولار Na2PO4، 187.5 میلی مولار NaCl، 25 میلی مولار HEPES و 125 میلی مولار NaHCO3 لیز شدند.مخلوط در 5000 گرم به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شد و گلوله با 10 میکرولیتر DSS (25 میلی‌مولار در DMSO) و 40 میکرولیتر بافر واکنش ASC به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بخیه شد.پس از سانتریفیوژ در 5000 گرم به مدت 10 دقیقه، گلوله در محلول 40 میکرولیتر بافر واکنش ASC و 10 میکرولیتر بافر بارگیری پروتئین 6 برابر (TransGen، پکن، چین) حل شد و سپس محلول در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه خاموش شد. دقیقه، سپس 10 دقیقه بجوشانید.سپس نمونه‌های پروتئینی با استفاده از آنتی‌بادی‌های اولیه ضد ASC (Wanleibio، Shenyang، چین) با نسبت رقت 1:500 تحت وسترن بلات قرار گرفتند.
به دنبال روشی که قبلاً شرح داده شد [13]، رویی کشت سلولی برداشت شد و ترشح سیتوکین پیش التهابی IL-1β با استفاده از کیت IL-1 Beta ELISA موش (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) تعیین شد.با استفاده از منحنی استاندارد IL-1β مقادیر OD450nm را به غلظت پروتئین تبدیل کنید.
سلول های پوشانده شده روی روکش ها به آرامی 3 بار در PBS گرم شسته شدند، در فیکساتور سلول بافتی (Biosharp، پکن، چین) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق (RT)، در 0.1٪ Triton X-Permeabilize در 100 (رقیق شده در PBS؛ Biosharp) ثابت شدند. ) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق و بلوک در آلبومین سرم 5 درصد گاوی (در PBS) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق.سپس سلول‌ها یک شبه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با آنتی‌بادی‌های اولیه علیه ASC (رقت 1:100) یا NLRP3 (رقت 1:100) به ترتیب، و IgG (H+L) بز ضد خرگوش نشاندار شده با Cy3 (1:400؛ EarthOx) انکوبه شدند. ، سانفرانسیسکو، کالیفرنیا، ایالات متحده) یا IgG ضد موش بز کونژوگه با FITC (1:400؛ Earthox) یک شبه در دمای 37 درجه سانتیگراد در تاریکی به مدت 1 ساعت.هسته ها با Hoechst 33258 (10 میکروگرم بر میلی لیتر؛ UE، سوژو، چین) به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند و زیر میکروسکوپ فلورسانس (شرکت المپوس، توکیو، ژاپن) مشاهده شدند.
موش ها به چهار گروه تقسیم شدند (تعداد = 7 در هر گروه): (i) گروه کنترل منفی تحت درمان با PBS (فقط PBS؛ 100 میکرولیتر PBS به موش و سپس تزریق روزانه 100 میکرولیتر در موش PBS 3 ساعت بعد) با گاواژ.، به طور مداوم به مدت 7 روز)؛(ب) گروه کنترل منفی تحت درمان با مهارکننده MCC950 [27] (100 میکرولیتر در موش از طریق گاواژ PBS، 3 ساعت بعد، 10 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن [BW] MCC950 [در PBS] به صورت داخل صفاقی روزانه، به مدت 7 روز) تجویز شد.(iii) گروه عفونت کیست G. duodenalis (1.5 x 106 کیست در موش با گاواژ، 3 ساعت بعد، 100 میکرولیتر / موش PBS داخل صفاقی روزانه به مدت 7 روز).(IV) گروه درمان عفونت ترکیبی کیست G. duodenalis گروه درمان با مهارکننده MCC950 (106×1.5 کیست در موش از طریق گاواژ، mg/kg 10 MCC950 به صورت داخل صفاقی روزانه به مدت 7 روز در 3 ساعت).وزن بدن هر موش روزانه کنترل شد و تمام موش ها در روز هفتم معدوم شدند.اثنی عشر برداشت شده (طول 3 سانتی متر) به قطعات کوچک در 1 میلی لیتر PBS بریده شد، کیست ها یک شبه در PBS در دمای 4 درجه سانتی گراد از بین رفتند و تروفوزوئیت های G. duodenalis.اثنی عشر تازه به طول 1 سانتی متر برای رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) جدا شد.
موش ها به دو گروه تقسیم شدند: (1) گروه کنترل MOCK و (ب) گروه مهارکننده MCC950.در هر گروه پنج درمان وجود داشت (7 نفر/گروه درمان): (i) گروه کنترل منفی درمان با PBS (فقط PBS؛ 100 میکرولیتر در موش PBS، تزریق داخل عضلانی (IM) (تیبیالیس قدامی) [28، 29]؛ ( ii) گروه کنترل منفی پلاسمید pcDNA3.1 (100 میکروگرم/DNA موش، از طریق تزریق عضلانی) گروه تحت درمان با پلاسمید pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 میکروگرم/DNA موش، با تزریق عضلانی)، و (v) گروهی که با پلاسمید pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 میکروگرم در موش) درمان شدند. پس از گذشت 12 ساعت از DNA، موش‌های گروه مهارکننده MCC950 تزریق داخل صفاقی MCC950 (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) را به مدت 7 روز دریافت کردند، در حالی که موش‌های گروه MOCK حجم مساوی از تیمار PBS را دریافت کردند. نمونه‌های خون دریافت شدند. نمونه‌های سرمی از موش‌های کره چشم جمع‌آوری شد و یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد رها شد.
سی و پنج موش به پنج گروه (n=7/گروه) تقسیم شدند.گروه 1 یک گروه کنترل منفی تحت درمان با PBS بود: موش ها 100 میکرولیتر PBS را به صورت عضلانی و 3 روز بعد از طریق گاواژ دریافت کردند.گروه 2 یک گروه کنترل مثبت آلوده به کیست G. duodenalis است: به موش ها 100 میکرولیتر PBS تزریق شد و 3 روز بعد 1.5 x 106 کیست به موش به داخل معده تزریق شد.گروه سوم - ایمن سازی پلاسمید با pcDNA3.1(+) در ترکیب با گروه کنترل برای عفونت کیست دوازدهه: موش ها 100 میکروگرم DNA پلاسمید pcDNA3.1(+)(im) خوراکی، 1.5×106 کیست/موش 3 برای چندین مورد دریافت کردند. روزها.گروه 4 و 5 پلاسمید pcDNA3.1(+)-alpha-2 ژیاردین نوترکیب یا پلاسمید pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ژیاردین در ترکیب با عفونت کیست G. duodenalis بودند.گروه آزمایش: موش‌ها 100 میکروگرم pcDNA3 دریافت کردند.1(+)-ژیاردین پلاسمید DNA (IM)، سپس 3 روز بعد، 1.5 × 106 کیست به موش از طریق گاواژ تزریق شد.وزن بدن هر موش پس از معرفی کیست G. duodenalis از طریق لوله بررسی شد.اثنی عشر تازه برای اندازه گیری بار انگلی و تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی HE جمع آوری شد.
تغییرات هیستوپاتولوژیک بر اساس روشی که قبلا منتشر شده بود [30] تجزیه و تحلیل شد.اثنی عشر تازه با تثبیت کننده سلول های بافتی تثبیت شد، در پارافین جاسازی شد، به بخش های 4 میکرومتر بریده شد، با H&E رنگ آمیزی شد و در زیر میکروسکوپ نوری آنالیز شد.نمایانگر تغییرات پاتولوژیک در هفت بخش بافت از هفت موش مستقل توسط آسیب شناس ناآگاه از درمان ارزیابی شد و با بزرگنمایی 200 برابر ضبط شد.طول پرزها و عمق دخمه ها مطابق با روش های توصیف شده قبلی اندازه گیری شد.
نتایج in vitro و in vivo در سه تکرار به دست آمد.نمودارها با استفاده از GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) تولید شدند.تفاوت بین دو گروه با استفاده از آزمون t مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، در حالی که تفاوت بین گروه های بیش از 3 با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم افزار SPSS (نسخه 22.0؛ SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) تجزیه و تحلیل شد.داده ها از نظر همگنی واریانس با استفاده از آزمون Levene و سپس آزمون تعقیبی بونفرونی (B) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.معناداری به صورت P<0.05، P<0.01، P<0.001 (نه معنی دار [ns]) بیان می شود (P>0.05).
تجزیه و تحلیل قبلی ما از پروتئومیکس GEV در دایره المعارف ژن ها و ژنوم های کیوتو (KEGG) نشان داد که بسیاری از اهداف ممکن است در فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ التهابی دخیل باشند [13].ما دو هدف امیدوارکننده، آلفا-2 و آلفا-7.3 ژیاردین را انتخاب کردیم، این مولکول ها را تقویت کردیم و از آنها برای ساختن بردار بیان یوکاریوتی pcDNA3.1(+) استفاده کردیم.پس از تعیین توالی، پلاسمیدهای بیانی pcDNA3.1(+)-α-2 و آلفا-7.3 ژیاردین به ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش ترانسفکت شدند و پروتئین امضاکننده التهاب کاسپاز-1 p20 (بخشی از کاسپاز-1 فعال شده) شناسایی شد. به عنوان مولکول های کلیدی که می توانند باعث التهاب شوند.نتایج نشان داد که آلفا-2 و آلفا-7.3 ژیاردین می توانند بیان p20 کاسپاز-1 مشابه GEV را القا کنند.هیچ تاثیری بر فعال سازی کاسپاز-1 در کنترل منفی تیمار نشده (فقط PBS) و کنترل پلاسمید pcDNA3.1(+) یافت نشد (شکل 1).
اندازه‌گیری فعال‌سازی کاسپاز-۱ p20 توسط pcDNA3.1(+)-alpha-2 و آلفا-7.3 ژیاردین.پلاسمیدهای بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1 (+)-alpha-2 و ژیاردین های آلفا-7.3 (بالای هر خط) به ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش ترانسفکت شدند و رویی کشت 24 ساعت بعد برداشت شد.وسترن بلات برای اندازه گیری سطح بیان پروتئین التهابی کاسپاز 1 p20 مورد استفاده قرار گرفت.گروه درمان فقط PBS (خط C) و گروه تک درمانی pcDNA3.1 (+) (pcDNA3.1 lane) به عنوان کنترل منفی و گروه درمان GEV به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.بیان پروتئین نوترکیب با تشخیص برچسب هیستیدین در هر پروتئین تایید شد و باندهای پروتئین مورد انتظار آلفا-2 ژیاردین (38.2 کیلو دالتون) و آلفا-7.3 ژیاردین (37.2 کیلو دالتون) بودند.GEV، وزیکول های خارج سلولی ژیاردیا دوازدهه، pcDNA3.1(+)، وکتور خطی EcoRV، SUP، مایع رویی
برای تعیین اینکه آیا آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین بیان کاسپاز-1 p20 را القا می کنند و در فعال کردن پاسخ التهابی میزبان NLRP3 نقش دارند، pcDNA3.1(+)-alpha-2 ژیاردین و pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 ژیاردین به ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش با DNA پلاسمید نوترکیب ترانسفکت شد و سطح بیان، محلی‌سازی و الیگومریزاسیون پروتئین‌های التهابی کلیدی NLRP3 تعیین شد.در این آزمایش از GEV به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شد و گروه بدون درمان (فقط PBS) یا گروه درمان ترانسفکشن pcDNA3.1 (+) گروه منفی بود.نتایج نشان داد که همانند گروه GEV، DNA پلاسمید نوترکیب ژیاردین pcDNA3.1(+)-alpha-2 و giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 منجر به تنظیم دخیل NLRP3، pro-IL-1β و فعال سازی پروکاسپاز-1 و کاسپاز-1 (شکل 2a).علاوه بر این، هر دو ژیاردین ترشح IL-1β قابل توجهی را القا کردند (pcDNA3.1: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.1000؛ آلفا-2 ژیاردین: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.0007 ).;آلفا-7.3 ژیاردین: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P<0.0001;GEV: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.0047) (شکل 2b).بیشتر پروتئین‌های ASC در گروه بدون درمان یا در گروه درمان ترانسفکت شده با پلاسمید pcDNA3.1(+) مونومر بودند، برخلاف pcDNA3.1(+)-alpha-2 یا pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 ژیاردین.الیگومریزاسیون ASC در DNA پلاسمید نوترکیب گروه یا گروه کنترل مثبت GEV رخ داد که شکل الیگومری را نشان می دهد (شکل 2c).این داده های اولیه نشان می دهد که آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7،3 ژیاردین می توانند باعث فعال شدن التهاب NLRP3 شوند.مطالعات ایمونوفلورسانس بعدی در مورد محلی سازی ASC و NLRP3 نشان داد که در گروه کنترل منفی، پروتئین ASC در سراسر سیتوپلاسم پراکنده شده بود و به عنوان یک سیگنال نقطه ای پس از تحریک pcDNA3.1(+)-alpha-2 با ژیاردین یا pcDNA3 ظاهر شد.گروه ژیاردین 1(+)-آلفا-7،3 یا گروه کنترل مثبت GEV (شکل 2d).در گروه کنترل منفی و pcDNA 3.1 تیمار شده با پلاسمید، سیگنال پروتئین NLRP3 شناسایی نشد، در حالی که یک نقطه سیگنال فلورسنت در پاسخ به pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine یا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 شناسایی شد..ژیاردین در سیتوپلاسم یا بر اثر تحریک HEV یافت می شود (شکل 2e).این داده ها بیشتر نشان می دهد که G. duodenalis giardin alpha-2 و giardin alpha-7.3 التهاب NLRP3 را در ماکروفاژهای صفاقی اولیه موش فعال می کنند.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin و pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin التهاب NLRP3 را در ماکروفاژهای صفاقی موش فعال می کنند.پلاسمیدهای بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin و pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin را به ماکروفاژها و سلول های صفاقی اولیه موش منتقل کنید، یا مایع رویی را ظرف 24 ساعت برای تجزیه و تحلیل بیان، الیگومریزاسیون برداشت کنید. ، ترشح.و محلی سازی پروتئین های التهابی کلیدیگروه PBS-only (C) و گروه pcDNA3.1(+) تنها به عنوان کنترل منفی و گروه درمانی GEV به عنوان گروه مثبت استفاده شد.پروتئین‌های التهابی کلیدی NLRP3، از جمله NLRP3، pro-IL-1β، pro-caspase-1، و p20 caspase-1، توسط وسترن بلات شناسایی شدند.سطح ترشح IL-1β در سوپرناتانت با استفاده از روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) تعیین شد.تفاوت بین گروه های کنترل و آزمایش با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.ستاره ها تفاوت معنی داری بین گروه ها را نشان می دهد **P<0.01 و ***P<0.001.سطوح الیگومریزاسیون ASC در گلوله ها با تجزیه و تحلیل پیوند متقابل DSS تعیین شد، در حالی که سطوح ASC در لیزات سلولی به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد.d تجسم محلی سازی ISC با استفاده از ایمونوفلورسانس.ایمونوفلورسانس برای تجسم محلی سازی NLRP3 استفاده شد.ASC، پروتئین لکه مانند آپوپتوز؛IL، اینترلوکین؛NLRP3، گیرنده شبه الیگومریزاسیون متصل شونده به نوکلئوتید 3.ns، معنی دار نیست (P > 0.05)
هم G. duodenalis و هم GEV هایی که ترشح می کند، التهاب NLRP3 را فعال می کنند و پاسخ های التهابی میزبان را در شرایط آزمایشگاهی تنظیم می کنند.بنابراین، نقش التهاب NLRP3 در بیماریزایی G. duodenalis نامشخص است.برای بررسی این موضوع، آزمایشی را بین موش‌های آلوده به کیست G. duodenalis و موش‌های آلوده به کیست G. duodenalis + درمان مهارکننده MCC950 طراحی کردیم و بیان NLRP3 التهابی را در هنگام آلوده شدن به کیست G. duodenalis مقایسه کردیم.یک طرح دقیق از آزمایش در شکل 3a نشان داده شده است.تغییرات وزن بدن موش‌ها در گروه‌های درمانی مختلف به مدت 7 روز پس از عفونت با کیست بررسی شد و نتایج در شکل 3b نشان داده شده است.در مقایسه با گروه تحت درمان با PBS خالص، نتایج نشان داد که (i) وزن بدن موش‌های آلوده به کیست G. duodenalis از روز 3 تا 7 پس از عفونت کاهش یافت.(ب) درمان با مهارکننده MCC950 هیچ تاثیر قابل‌توجهی بر وزن بدن موش‌ها نداشت..در مقایسه با گروه عفونت منفرد، BW گروه عفونت دوازدهه تحت درمان با MCC950 به درجات مختلفی کاهش یافت (روز 1: ANOVA، F(3، 24) = 1.885، P = 0.0148؛ روز 2: ANOVA، F(3، 24). ) = 0.4602، P<0.0001; (3، 24)=0.6497، P=0.0645;این داده ها نشان می دهد که التهاب NLRP3 از موش ها در برابر کاهش وزن قابل توجه در مراحل اولیه (2-4 روز) عفونت اثنی عشر محافظت می کند.سپس هدف ما شناسایی تروفوزوئیت های G. duodenalis در مایع لاواژ دوازدهه بود و نتایج در شکل 3c نشان داده شده است.در مقایسه با گروه عفونت کیست G. duodenalis، تعداد تروفوزوئیت ها در دوازدهه پس از مسدود کردن التهاب NLRP3 به طور قابل توجهی افزایش یافت (t (12) = 2.902، P = 0.0133).بافت‌های دوازدهه رنگ‌آمیزی شده با HE در مقایسه با کنترل منفی تیمار شده با PBS و MCC950 به تنهایی نشان دادند: (i) عفونت کیست G. duodenalis منجر به آسیب به پرزهای دوازدهه شد (ANOVA، F(3، 24)=0.4903، P=0.0488. ) و آتروفی کریپت (ANOVA، F(3، 24) = 0.4716، P = 0.0089).(ب) اثنی عشر از موش های آلوده به کیست G. duodenalis و تحت درمان با مهارکننده های MCC950.پرزهای دوازدهه آسیب دیده و مرده بودند (ANOVA، F(3، 24) = 0.4903، P = 0.0144) با آتروفی و ​​انشعاب کریپت (ANOVA، F(3، 24) = 0.4716، P = 0، 0481) (شکل 3d- و) .این نتایج نشان می دهد که التهاب NLRP3 در کاهش بیماری زایی G. duodenalis نقش دارد.
نقش التهاب NLRP3 در عفونت ژیاردیا دوازدههموش‌ها با کیست‌های دئودنوکوک (IV) گاواژ شدند و سپس با یا بدون MCC950 (IP) درمان شدند.گروه‌های درمانی منفرد با PBS یا MCC950 به عنوان شاهد استفاده شدند.گروه آزمایش و رژیم درمانی.b وزن بدن موش ها در هر یک از گروه های درمانی مختلف به مدت 7 روز کنترل شد.تفاوت بین گروه عفونت G. duodenalis و گروه درمان عفونت G. duodenalis + MCC950 با استفاده از آزمون t با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22.0 تجزیه و تحلیل شد.ستاره ها تفاوت معنی داری را در *P<0.05، **P<0.01 یا ***P<0.001 نشان می دهند.c بار انگلی با شمارش تعداد تروفوزوئیت ها در مایع لاواژ اثنی عشر تعیین شد.تفاوت بین گروه عفونت G. duodenalis و گروه درمان عفونت G. duodenalis + MCC950 با استفاده از آزمون t با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22.0 تجزیه و تحلیل شد.ستاره ها تفاوت معنی داری را در *P <0.05 نشان می دهند.d نتایج رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) در هیستوپاتولوژی دوازدهه.فلش های قرمز نشان دهنده آسیب به پرزها، فلش های سبز نشان دهنده آسیب به دخمه ها است.نوار مقیاس: 100 میکرومترe, f تجزیه و تحلیل آماری ارتفاع پرز دوازدهه و ارتفاع کریپت موش.ستاره ها تفاوت معنی داری را در *P<0.05 و **P<0.01 نشان می دهند.نتایج از 7 آزمایش بیولوژیکی مستقل گرفته شده است.BW، وزن بدن؛ig، مسیر زایمان داخل معده؛ip، مسیر زایمان داخل صفاقی؛ns، معنی دار نیست (P > 0.05).PBS، سالین بافر فسفات؛WT، نوع وحشی
ترشح IL-1β مشخصه فعال شدن التهاب است.برای تعیین اینکه آیا G. duodenalis آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین التهاب میزبان NLRP3 را در داخل بدن فعال می کنند، از موش های WT درمان نشده (گروه شم) و موش های مسدود شده با التهاب NLRP3 (گروه درمان مهار شده MCC950) استفاده کردیم.یک طرح دقیق از آزمایش در شکل 4a نشان داده شده است.گروه‌های آزمایشی شامل موش‌های تحت درمان با PBS، درمان کیست G. duodenalis با گاواژ، تزریق داخل عضلانی pcDNA3.1، و تزریق داخل عضلانی pcDNA3.1 (+)-alpha-2 ژیاردین یا pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین بودند.در روز هفتم پس از تزریق داخل عضلانی پلاسمید نوترکیب، سرم جمع آوری و سطح IL-1β در هر گروه تعیین شد.همانطور که در شکل 4b نشان داده شده است، در گروه MOCK: (i) در مقایسه با گروه PBS، تیمار pcDNA3.1 اثر قابل توجهی بر ترشح IL-1β نداشت (ANOVA، F(4.29)=4.062، P=0.9998)، با این حال، ترشح IL-β در گروه کیست G. duodenalis به طور قابل توجهی افزایش یافت (ANOVA، F(4، 29) = 4.062، P = 0.0002)، (II) pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین و pcDNA3.1- تزریق عضلانی آلفا-7.3 ژیاردین به طور قابل توجهی باعث افزایش سطح سرمی IL-1β شد (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001).(iii) pcDNA3.1-alpha-7،3 ژیاردین سطوح بالایی از ترشح IL-1β را در گروه تزریق عضلانی pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین القا کرد (ANOVA، F(4، 29) = 4.062، P = 0.0333) .در مقایسه با هر گروه در گروه درمانی MCC950 و گروه MOCK: (i) سطح ترشح IL-1β در گروه کنترل PBS و گروه کنترل pcDNA3.1 پس از مسدود کردن مهار کننده MCC950 تا حدی کاهش یافت، اما تفاوت مشاهده نشد. معنی دار (PBS: ANOVA، F (9، 58) = 3.540، P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA، F(9، 58) = 3.540، P = 0.5949).(ii) پس از مسدود کردن MCC950.ترشح IL-1β در گروه آلوده به کیست G. duodenalis، گروه pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین، و pcDNA3.1-alpha-7.3 گروه ژیاردین به طور قابل توجهی کاهش یافت (G. duodenalis: ANOVA, F(9 ، 58) = 3.540، P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین: ANOVA، F(9، 58) = 3.540، P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3: ANOVA، F( ) = 3.540، P = 0.0164).این نتایج نشان می دهد که آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین واسطه فعال شدن التهاب NLRP3 در داخل بدن هستند.
pcDNA3.1(+)-ژیاردین ها التهاب میزبان NLRP3 را در داخل بدن فعال می کنند.موش ها با پلاسمید بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1(+)-alpha-2 ژیاردین یا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ژیاردین ایمن سازی شدند و سپس با MCC950 (IP؛ گروه MCC950) یا نه (گروه ساختگی) تحت درمان قرار گرفتند. ).گروه درمان پلاسمید PBS یا pcDNA3.1(+) به عنوان کنترل منفی، گروه درمان کیست G. duodenalis به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.گروه آزمایش و رژیم درمانی.سطح سرمی IL-1β در موش در روز 7 با روش الایزا اندازه گیری شد.تفاوت بین گروه ها در گروه MOCK با استفاده از ANOVA یک طرفه و تفاوت بین گروه MOCK و گروه MCC950 با استفاده از آزمون t نرم افزار SPSS نسخه 22.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.ستاره ها نشان دهنده تفاوت معنی داری بین گروه های درمانی در گروه MOCK، *P<0.05 و ***P<0.001;علائم دلار ($) تفاوت معنی داری را بین هر گروه در گروه MOCK و گروه MCC950 در P<0.05 نشان می دهد.نتایج هفت آزمایش بیولوژیکی مستقلi، تزریق عضلانی، ns، معنی دار نیست (P> 0.05)
برای بررسی اثر فعال سازی آلفا-2 و آلفا-7.3 ژیاردین التهابی میزبان NLRP3 بر عفونت G. duodenalis، ما از موش های WT C57BL/6 استفاده کردیم و آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین را تزریق کردیم.پلاسمید پس از 3 روز از طریق لوله معده کیست G. duodenalis به صورت عضلانی تزریق شد و پس از آن موش ها به مدت 7 روز مشاهده شدند.یک طرح دقیق از آزمایش در شکل 5a نشان داده شده است.وزن بدن هر موش هر روز اندازه‌گیری شد، نمونه‌های بافت تازه دوازدهه در روز هفتم پس از تجویز از طریق لوله معده جمع‌آوری شد، تعداد تروفوزوئیت‌ها اندازه‌گیری شد و تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شد.همانطور که در شکل 5b نشان داده شده است، با افزایش زمان تغذیه، وزن بدن موش ها در هر گروه به تدریج افزایش یافت.MT موش ها در روز سوم پس از تجویز داخل معده کیست G. duodenalis شروع به کاهش کرد و سپس به تدریج افزایش یافت.فعال شدن التهاب NLRP3 ناشی از تزریق عضلانی آلفا-2 ژیاردین و آلفا7.3 ژیاردین به طور قابل توجهی کاهش وزن را در موش ها کاهش داد (روز 1: pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 1.399، P. = 0.9754 روز 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30)=1.399، P=0.9987 روز 2: pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.3172، P = 0.9979; 4، 30) = 0.8222، P = 0.0262 روز 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.8222، P = 0.0083 روز 4: pcDNA3.1-ANOVA ، F(4، 30) = 0.5620، P = 0.0012، روز 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.5620، P <0.0001، روز 5: pcDNA3.1-alpha - 2 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.9728، P <0.0001 روز 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.9728، P <0.0001 روز 6: pcDNA3. آلفا-2 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.7154، P = 0.0012، روز 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.7154، P = 0.0006;روز 7: pcDNA3.1-alpha-2 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.5369، P<0.0001 روز 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین، ANOVA، F(4، 30) = 0.5369، P <0.0001).بار انگلی در دوازدهه ارزیابی شد (شکل 5c).در مقایسه با کنترل مثبت تیمار نشده و گروهی که با وکتور خالی pcDNA3.1 تزریق شده بود، تعداد تروفوزوئیت های G. duodenalis در گروه های تزریق شده با α-2 ژیاردین و α-7،3 ژیاردین (pcDNA3.1-alpha) به طور قابل توجهی کاهش یافت. -2 ژیاردین: ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P = 0.0002، pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین: ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P<0.0001).علاوه بر این، ژیاردین آلفا-7.3 در موش ها از ژیاردین آلفا-2 محافظت بیشتری داشت (ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P = 0.0081).نتایج رنگ آمیزی HE در شکل نشان داده شده است.5d–f.موش های تزریق شده با آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین در مقایسه با موش های تزریق شده با G. duodenalis و موش هایی که با G. duodenalis در ترکیب با یک وکتور خالی pcDNA3 زوم 0.1 تزریق شده بودند، ضایعات بافت دوازدهه کمتری داشتند که با آسیب پرز آشکار می شد.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA، F(3، 24) = 2.466، P = 0.0035 یا P = 0.0068؛ pcDNA3.1-alpha-7.3 ژیاردین: ANOVA، F(3، 24) = 2.466، P = 0.0028 یا P = 0.0055) و کاهش آتروفی کریپت (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA، F(3، 24) = 1.470، P = 0.0264 یا P = 0.0158؛ pcDNA3.1-alpha-2: AVA3. ، F(3، 24) = 1.470، P = 0.0371 یا P = 0.0191).این نتایج نشان می دهد که آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7،3 ژیاردین با فعال کردن NLRP3 inflammasome در داخل بدن، عفونت G. duodenalis را کاهش می دهند.
نقش pcDNA3.1 (+) -ژیاردین در عفونت G. duodenalis.موش ها (IM) با پلاسمیدهای بیان یوکاریوتی نوترکیب pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine یا pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ژیاردین و سپس با کیست G. duodenalis (IG) به چالش کشیده شدند.گروه PBS و گروه pcDNA3.1 (+) + کیست دوازدهه به عنوان گروه کنترل منفی و گروه درمان کیست دوازدهه به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شد.گروه آزمایش و رژیم درمانی.b MT موش ها در هر یک از گروه های درمانی مختلف به مدت 7 روز پس از چالش کنترل شد.ستاره ها تفاوت معنی داری را بین گروه ها در گروه G. duodenalis و گروه pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine نشان می دهند.علامت دلار ($) نشان دهنده تفاوت معنی داری بین هر گروه از G. duodenalis و گروه pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine، $$P<0.01 و $$$P<0.001 است.c بار انگلی با شمارش تعداد تروفوزوئیت ها در 1 میلی لیتر شستشوی اثنی عشر از اثنی عشر (طول 3 سانتی متر) تعیین شد و به عنوان تعداد انگل در هر سانتی متر از دوازدهه بیان شد.تفاوت بین گروه عفونت G. duodenalis، گروه pcDNA3.1(+)-alpha-2 ژیاردین، و گروه pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ژیاردین با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22.0 با استفاده از ANOVA یک طرفه تجزیه و تحلیل شد.ستاره ها تفاوت معنی داری را در **P<0.01 و ***P<0.001 نشان می دهند.د تغییرات هیستوپاتولوژیک در دوازدهه.فلش های قرمز نشان دهنده آسیب به پرزها، فلش های سبز نشان دهنده آسیب به دخمه ها است.نوار مقیاس: 100 میکرومترe, f تجزیه و تحلیل آماری ارتفاع پرز دوازدهه موش (e) و ارتفاع کریپت (f).تفاوت بین گروه ها در شکل 1d با استفاده از ANOVA یک طرفه با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22.0 تجزیه و تحلیل شد.ستاره ها تفاوت معنی داری را در *P<0.05 و **P<0.01 نشان می دهند.نتایج هفت آزمایش بیولوژیکی مستقلns، معنی دار نیست (P > 0.05)
ژیاردیا دوازدهه یک انگل روده شناخته شده در انسان و سایر پستانداران است که باعث ژیاردیازیس می شود.در سال 2004، به دلیل شیوع بالای آن در طی 6 سال، به ویژه در جوامع با وضعیت اقتصادی-اجتماعی پایین، در ابتکار بیماری های نادیده گرفته شده سازمان بهداشت جهانی قرار گرفت [32].سیستم ایمنی ذاتی نقش مهمی در پاسخ ایمنی به عفونت G. duodenalis ایفا می کند.گزارش شده است که ماکروفاژهای موش با آزاد کردن تله های خارج سلولی G. duodenalis را می بلعند و می کشند [33].مطالعات قبلی ما نشان داده است که G. duodenalis، یک انگل خارج سلولی غیر تهاجمی، مسیرهای سیگنالینگ التهابی p38 MAPK، ERK، NF-κB p65، و NLRP3 را در ماکروفاژهای موش فعال می کند تا پاسخ های التهابی میزبان را تنظیم کند و GEV آزاد شده ممکن است این فرآیند را تقویت کند.13]، 24].با این حال، PAMPهای دقیق درگیر در التهاب تنظیم‌شده با NLRP3 در GEV و نقش التهاب NLRP3 در ژیاردیازیس هنوز مشخص نشده است.برای روشن شدن این دو سوال، این مطالعه را انجام دادیم.
التهاب NLRP3 در سیتوپلاسم سلول های ایمنی قرار دارد و می تواند توسط ذرات مختلفی مانند کریستال های اسید اوریک، سموم، باکتری ها، ویروس ها و انگل ها فعال شود.در مطالعات باکتریایی، سموم به عنوان PAMP های کلیدی شناسایی شده اند که حسگرهای التهابی را فعال می کنند و منجر به التهاب و مرگ سلولی می شوند [34].برخی از سموم از نظر ساختاری متنوع، مانند همولیزین از استافیلوکوکوس اورئوس [35] و اشرشیاکلی [36]، همولیزین BL (HBL) از انتروتوکسین (NHE) [37]، باعث فعال شدن التهاب NLRP3 می شوند.مطالعات ویروسی نشان داده‌اند که پروتئین‌های حدت مانند پروتئین SARS-COV-2 (E) [38] و پروتئین NS5 ویروس زیکا [39] PAMP‌های مهمی هستند که توسط گیرنده NLRP3 شناسایی می‌شوند.در مطالعات انگل، بسیاری از انگل‌ها با فعال شدن التهاب میزبان مرتبط هستند، مانند توکسوپلاسما گوندی، تریکوموناس واژینالیس [40]، تریپانوزوما کروزی [41] و لیشمانیا [42].پروتئین های گرانول متراکم GRA35، GRA42 و GRA43، مرتبط با حدت توکسوپلاسما گوندی، برای القای پیروپتوز در ماکروفاژهای موش لوئیس مورد نیاز هستند [43].علاوه بر این، برخی از مطالعات لیشمانیا بر روی مولکول های فردی درگیر در التهاب NLRP3، مانند لیپوفسفوگلیکان غشای انگل [44] یا متالوپروتئاز روی [45] متمرکز شده اند.در میان خانواده ژن‌های آلفا ژیاردین شبه انکسین، آلفا 1 ژیاردین به عنوان یک واکسن بالقوه برای محافظت در برابر G. duodenalis در مدل موش نشان داده شده است [18].در مطالعه ما، فاکتورهای حدت G. duodenalis آلفا-2 و آلفا-7،3 ژیاردین را انتخاب کردیم که منحصر به ژیاردیا هستند اما نسبتاً کمتر گزارش شده اند.این دو ژن هدف در وکتور سیستم بیان یوکاریوتی pcDNA3.1 (+) برای تجزیه و تحلیل فعال‌سازی التهاب کلون شدند.
در مدل موش ما، قطعات کاسپاز بریده شده به عنوان نشانگرهای فعال سازی التهابی عمل می کنند.پس از تحریک، NLRP3 با ASC تعامل می‌کند، پروکاسپازها را جذب می‌کند و کاسپازهای فعالی تولید می‌کند که pro-IL-1β و pro-IL-18 را به ترتیب به IL-1β و IL-18 بالغ می‌شکنند.کاسپازهای التهابی (کاسپازهای ۱، ۴-، ۵- و ۱۱-) خانواده ای از سیستئین پروتئازها هستند که برای دفاع ذاتی حیاتی هستند و در التهاب و مرگ برنامه ریزی شده سلولی نقش دارند [46].کاسپاز 1 توسط التهابات متعارف [47] فعال می شود، در حالی که کاسپازهای 4، 5- و 11 در طی تشکیل التهاب غیر معمولی شکسته می شوند [48].در این مطالعه، ما از ماکروفاژهای صفاقی موش به عنوان مدل استفاده کردیم و کاسپاز 1 شکافته شده p20 کاسپاز 1 را به عنوان نشانگر فعال شدن التهاب NLRP3 میزبان در مطالعات عفونت G. duodenalis بررسی کردیم.نتایج نشان داد که بسیاری از آلفا ژیاردین ها مسئول فعال سازی معمول التهاب هستند که با کشف مولکول های بیماری زای کلیدی درگیر در باکتری ها و ویروس ها مطابقت دارد.با این حال، مطالعه ما فقط یک غربالگری اولیه است و مولکول‌های دیگری نیز وجود دارند که می‌توانند التهاب‌های غیرکلاسیک را فعال کنند، همانطور که مطالعه قبلی ما التهابات کلاسیک و غیرکلاسیک را در عفونت G. duodenalis نشان داد [13].برای تعیین بیشتر اینکه آیا کاسپاز-1 p20 تولید شده با التهاب NLRP3 مرتبط است یا خیر، ما ژیاردین های آلفا-2 و آلفا-7.3 را به ماکروفاژهای صفاقی موش ترانسفکت کردیم تا سطوح بیان پروتئین مولکول کلیدی و سطوح الیگومریزاسیون ASC را تعیین کنیم و تأیید کنیم که هر دو α-ژیاردین فعال می شوند. NLRP3 التهابینتایج ما کمی متفاوت از نتایج Manko-Prykhoda و همکاران است که گزارش کردند تحریک سلول های Caco-2 با سویه های G. muris یا E. coli EPEC به تنهایی می تواند شدت فلورسانس NLRP3، ASC و کاسپاز-1 را افزایش دهد. اگرچه نه به طور قابل توجهی، در حالی که چگونه تحریک همزمان G. muris و E. coli سطوح سه پروتئین را افزایش داد [49].این اختلاف ممکن است به دلیل تفاوت در انتخاب گونه های ژیاردیا، رده های سلولی و سلول های اولیه باشد.ما همچنین سنجش‌های in vivo را با استفاده از MCC950 در موش‌های ماده 5 هفته‌ای WT C57BL/6 انجام دادیم که بیشتر به G. duodenalis حساس هستند.MCC950 یک مهارکننده قوی و انتخابی مولکول کوچک NLRP3 است که فعال‌سازی متعارف و غیر متعارف NLRP3 را در غلظت‌های نانومولار مسدود می‌کند.MCC950 فعال سازی NLRP3 را مهار می کند اما بر فعال شدن مسیرهای التهابی AIM2، NLRC4 و NLRP1 یا مسیرهای سیگنال دهی TLR تأثیر نمی گذارد [27].MCC950 فعال‌سازی NLRP3 را مسدود می‌کند اما شروع NLRP3، جریان K+، هجوم Ca2+ یا تعامل بین NLRP3 و ASC را مهار نمی‌کند.در عوض، با مسدود کردن الیگومریزاسیون ASC از فعال شدن التهاب NLRP3 جلوگیری می کند [27].بنابراین، ما از MCC950 در یک مطالعه in vivo برای تعیین نقش التهاب NLRP3 پس از تزریق ژیاردین استفاده کردیم.کاسپاز 1 p10 فعال شده، سیتوکین های پیش التهابی pro-IL-1β و pro-IL-18 را به IL-1β و IL-18 بالغ تقسیم می کند [50].در این مطالعه، سطح سرمی IL-1β در موش‌های تحت درمان با ژیاردین با یا بدون MCC950 به‌عنوان شاخص فعال شدن NLRP3 مورد استفاده قرار گرفت.همانطور که انتظار می رفت، درمان MCC950 به طور قابل توجهی سطوح سرمی IL-1β را کاهش داد.این داده ها به وضوح نشان می دهد که G. duodenalis giardin alfa-2 و giardin alfa-7.3 قادر به فعال کردن التهاب NLRP3 موش هستند.
داده های قابل توجهی که در دهه گذشته انباشته شده است نشان داده است که IL-17A تنظیم کننده اصلی ایمنی در برابر G. muris است که باعث ایجاد سیگنال IL-17RA، تولید پپتیدهای ضد میکروبی و تنظیم فعال سازی کمپلمان می شود [51].با این حال، عفونت ژیاردیا بیشتر در بزرگسالان جوان رخ می دهد، و گزارش شده است که عفونت ژیاردیا در موش های جوان، پاسخ IL-17A را برای اعمال اثر محافظتی خود فعال نمی کند [52]، و محققان را بر آن داشت تا به دنبال سایر ژیاردیاهای تعدیل کننده ایمنی باشند.مکانیسم های عفونت کرمینویسندگان یک مطالعه اخیر گزارش دادند که G. muris می تواند التهاب NLRP3 توسط E.coli EPEC را فعال کند، که تولید پپتیدهای ضد میکروبی را تقویت می کند و ظرفیت اتصال آن و تعداد تروفوزوئیت ها را در دستگاه روده کاهش می دهد و در نتیجه شدت کولون را کاهش می دهد. بیماری های ناشی از باسیل ها [49].التهاب NLRP3 در ایجاد بیماری های مختلف نقش دارد.مطالعات نشان داده اند که سودوموناس آئروژینوزا برای جلوگیری از مرگ سلولی باعث اتوفاژی در ماکروفاژها می شود و این فرآیند به فعال شدن التهاب NLRP3 بستگی دارد [53].برای N. caninum، فعال‌سازی با واسطه گونه‌های اکسیژن فعال التهابی NLRP3 تکثیر آن را در میزبان محدود می‌کند و آن را به یک هدف درمانی بالقوه تبدیل می‌کند [9].مشخص شده است که Paracoccidioides brasiliensis باعث فعال شدن التهاب NLRP3 در سلول های دندریتیک مشتق از مغز استخوان موش می شود و در نتیجه سیتوکین التهابی IL-1β را آزاد می کند که نقش مهمی در دفاع میزبان دارد [10].چندین گونه لیشمانیا، از جمله L. amazonensis، L. major، L. braziliensis و L. infantum chagasi، NLRP3 و کاسپاز 1 وابسته به ASC را در ماکروفاژها و همچنین عفونت لیشمانیا را فعال می کنند.تکثیر انگل در موش های فاقد ژن NLRP3/ASC/caspase-1 افزایش می یابد [11].زامبونی و همکارانگزارش شده است که عفونت لیشمانیا باعث فعال شدن التهاب NLRP3 در ماکروفاژها می شود که تکثیر انگل درون سلولی را محدود می کند.بنابراین، لیشمانیا ممکن است فعال سازی NLRP3 را به عنوان یک استراتژی اجتنابی مهار کند.در مطالعات in vivo، التهاب NLRP3 به از بین بردن لیشمانیا کمک کرد، اما بر بافت ها تأثیری نداشت [54].برعکس، در مطالعات کرمی، فعال‌سازی التهاب NLRP3 ایمنی محافظتی میزبان را در برابر کرم‌های روده‌ای سرکوب کرد [12].شیگلا یکی از اصلی ترین باکتری های عامل اسهال در سراسر جهان است.این باکتری ها می توانند تولید IL-1β را از طریق جریان K+ با واسطه گیرنده P2X7، گونه های فعال اکسیژن، اسیدی شدن لیزوزومی و آسیب میتوکندری القا کنند.التهاب NLRP3 فاگوسیتوز و فعالیت باکتری کشی ماکروفاژها را علیه شیگلا تنظیم می کند [55].مطالعات پلاسمودیوم نشان داده است که موش‌های دارای کمبود AIM2، NLRP3 یا کاسپاز 1 آلوده به پلاسمودیوم، سطوح بالایی از اینترفرون نوع 1 تولید می‌کنند و نسبت به عفونت پلاسمودیوم مقاوم‌تر هستند [56].با این حال، نقش آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین در القای فعال سازی بیماری زا التهاب NLRP3 در موش نامشخص است.
در این مطالعه، مهار التهاب NLRP3 توسط MCC950 باعث کاهش BW و افزایش تعداد تروفوزوئیت‌ها در مایع لاواژ روده در موش‌ها شد که منجر به تغییرات پاتولوژیک شدیدتر در بافت دوازدهه شد.آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7.3 ژیاردین التهاب NLRP3 موش میزبان را فعال می کنند، وزن بدن موش را افزایش می دهند، تعداد تروفوزوئیت ها را در مایع شستشوی روده کاهش می دهند و ضایعات پاتولوژیک اثنی عشر را کاهش می دهند.این نتایج نشان می دهد که G. duodenalis می تواند التهاب میزبان NLRP3 را از طریق آلفا-2 ژیاردین و آلفا-7،3 ژیاردین فعال کند و بیماری زایی G. duodenalis را در موش کاهش دهد.
در مجموع، نتایج ما نشان می‌دهد که ژیاردین‌های آلفا-2 و آلفا-7.3 باعث فعال شدن التهاب میزبان NLRP3 می‌شوند و عفونت G. duodenalis را در موش کاهش می‌دهند.بنابراین، این مولکول‌ها اهداف امیدوارکننده‌ای برای پیشگیری از ژیاردیازیس هستند.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS، Liang AAM، Huang AHC، Sergi KM، Kam JKM.ژیاردیازیس: یک مرور کلیاخیراً مشخص شد که Pat Inflamm به داروها حساسیت دارد.2019؛ 13:134-43.
Escobedo AA، Tsimerman S. Giardiasis: مروری بر فارماکوتراپی.نظر کارشناس داروساز.2007;8: 1885-902.
تیان هوافنگ، چن بین، ون جیان فنگ.ژیاردیازیس، مقاومت دارویی و کشف اهداف جدید.اهداف دارویی Disord را آلوده می کند.2010؛ 10:295-302.
Wang Z، Zhang X، Xiao Yi، Zhang W، Wu X، Qin T، و غیره. بیماری های التهابی و التهابی NLRP3.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020:4063562.
Chen GY، Núñez G. نقش التهاب در التهاب روده و سرطان.گوارش.2011;141:1986-99.
Pellegrini C، Antonioli L، Lopez-Castejon G، Blandizzi C، Fornai M. فعال سازی التهابی NLRP3 متعارف و غیر معمول در تقاطع تحمل ایمنی و التهاب روده.پیش ایمنی2017؛ 8:36.
لی ال، وانگ ایکس سی، گونگ پی تی، ژانگ ان، ژانگ ایکس، لی اس، و همکاران.فعال سازی التهابی NLRP3 با واسطه ROS در پاسخ به عفونت N. caninum نقش دارد.ناقل انگل.2020؛ 13:449.